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N-乙酰半胱氨酸对BDE-209致新生鼠海马神经元氧化损伤的影响及初步探讨BDE-209对海马神经元DNA甲基化水平的影响

作　者: 陈兢思
导　师: 陈敦金
学　校: 广州医学院
专　业: 妇产科学
关键词: BDE-209 NAC 海马神经元细胞形态观察细胞存活率超氧化物歧化酶(SOD) 丙二醛(MDA) 一氧化氮(NO) 整体DNA甲基化水平
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

多溴联苯醚(Plybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一些类含溴原子的芳香族化学物,从20世纪80年代起,人们发现阻燃剂多氯联苯(Polychlorinated biphenyl,PCBs)对人体健康有害,而PBDEs的化学结构与PCB相似,具有相似的阻燃作用,故作为多氯联苯(PCBs)的替代品,被广泛地应用在各种消费品种中。但PBDEs与PCBs一样是一种持续的环境有机污染物。随着工业的发展,PBDEs在世界范围的需求不断增加,环境中的PBDEs的浓度也逐年增多,已高于PCBs在环境中的浓度。PBDEs可沉积在水体和土壤中,并通过食物链,进入动物和人体。在人体的乳汁、脂肪、血液、肝脏等器官中均可检测出PBDEs。PBDEs的急性毒性很低,口服的半数致死量为>5g/kg。而慢性暴露在PBDEs时,其作用的靶器官为肝脏、肾脏、甲状腺、神经系统等。目前国内外对低溴联苯醚的相关毒性研究较多,而且较肯定。从大量动物实验中发现PBDEs可能具有肝毒性、生殖毒性、甲状腺毒性、神经发育毒性及潜在的致癌性等。因此,在欧盟及美国已禁止使用,十溴联苯醚(decabrominated BDE,BDE-209或DeBDE)的毒性较低溴联苯醚类低,在美国及欧洲仍允许生产使用。而我国不但是PBDEs的生产、使用和出口大国,其中十溴联苯醚(BDE-209)的生产使用量最大,而且还是接收电子垃圾的大国。BDE-209已成为我国重要的环境污染物。因此,我们深入对十溴联苯醚(BDE-209)的研究有一定的迫切性和必要性。BDE-209是使用最广泛的PBDEs,其毒性较低溴类低,但其可以在进入环境后,经光解、高温分解、生物及微生物降解等过程,转化成溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃及低溴代的联苯醚,引起更强的毒性作用。因此,对于BDE-209对机体是否存在有危害仍存在有很多争议,然而国内外展开了相关的实验。在动物研究发现,BDE-209能增加肝细胞癌的发生,使甲状腺激素分泌增加。BDE-209有胎毒性,在孕期接触BDE-209,能雄性子鼠的生殖功能受损。而神经发育毒性是近年人们最关注部分。这是因为在动物实验中发现,在孕期及产后暴露在多种PBDEs (包括BDE-47,153,209等)后,均会产生持久性的行为改变,特别在肌肉活动及认知、学习、记忆能力方面;而且近年发现乳汁中PBDEs的含量不断增加,母乳喂养的婴儿体内含有PBDEs的水平比非母乳喂养的婴儿高,而且婴幼儿体内PBDEs的浓度比成年人要高,这除了与母乳喂养有关之外,与接触房屋中的垃圾及婴幼儿排泄PBDEs的能力较低有关系。可见,对BDE-209的深入研究,对人类的环境健康及优生优育都具有重要的意义。我们的研究小组在前期实验中,对原代胎鼠海马神经元细胞进行BDE-209染毒后,发现在一定剂量的BDE-209作用下,原代胎鼠海马神经元细胞可发生凋亡及氧化损伤,并存在一定得剂量-反应关系,推测氧化应激可能是BDE-209引起神经毒性的重要机制之一。但目前BDE-209是如何导致学习记忆能力下降的机制仍不清楚,有否基因毒性仍不明确。本课题主要在细胞水平上研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对BDE-209致原代培养海马神经细胞氧化损伤的影响以及初步研究BDE-209对原代培养海马神经元细胞整体DNA水平甲基化的影响。DNA甲基化是一种基因表达调控的重要机制,在很多毒物毒性及疾病中起重要作用;正常DNA甲基化对于中枢神经功能具有重要意义,异常DNA甲基化状态与肿瘤、智力发育迟缓、免疫缺陷等疾病有一定的相关;对DNA甲基化状态的正确评估,有助于我们对BDE-209毒理机制的深入了解。本课题主要分为以下三部分:第一部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209致新生鼠海马神经元形态学改变的影响【实验目的】取新生24小时内的SD大鼠海马组织进行原代神经元细胞培养,鉴别神经元的纯度,观察N-乙酰半胱氨酸对BDE-209引起原代培养新生鼠海马神经元细胞形态结构的改变及细胞存活率下降的影响。【材料与方法】1.购买新生24小时内的SD大鼠,取海马组织进行原代神经元细胞培养。2.培养7天后海马神经元细胞进行神经元细胞纯度鉴别。3.原代培养7天的新生鼠海马神经元细胞分成11组,即对照组和实验组,对照组分为空白对照组(含有含1‰DMSO的培养液)和NAC对照组(含有0.1mmol/L NAC的培养液)。实验组分成I组(BDE-209单独染毒组)、II组(BDE-209与NAC同时作用)及III组(NAC先作用24小时后,BDE-209再染毒),各大组中均含有3个浓度的BDE-209小组, BDE-209浓度分别为10、30、50ug/ml。NAC浓度均为0.1mmol/L。每组设3个平行样,实验重覆3次。染毒24h后,在倒置显微镜下进行细胞形态观察。4.MTT比色分析检测神经元的存活率。【结果】1.原代海马神经元细胞培养第7天观察神经元细胞生长良好,胞体较大,胞突主干和分枝明显延长并增粗,其突起形成稠密的神经网络。2.免疫细胞化学法NeuN鉴定神经元的经典方法。由结果可见分散的海马神经元,神经元是主体,可占95%。3.倒置显微镜观察不同实验组神经元细胞形态,在实验I组中的10ug/ml组、30ug/ml组、50ug/ml组中可见神经元细胞胞体有所变小,变形,细胞膜完整但出现发泡现象,随着染毒剂量加大,发泡现象明显,其神经突起出现缩短,在50ug/ml组中可见有细胞出现皱缩、变圆、脱落,突起缩短甚至消失。在实验II组与III组中均可见神经元细胞胞体变形现象、细胞膜发泡现象有所减少,实验II组与III组之间的细胞形态无明显差异。4. MTT比色分析检测神经元的存活率,随BDE-209浓度增加,神经元细胞的存活率明显下降(P<0.05),II组及III组中的神经元细胞存活率均有所升高,但III组的神经元细胞存活率与I组比较,无统计学意义(P>0.05)。在II组与I组的细胞存活率比较,有明显增高(P<0.05),有统计学意义(P>0.05)。【结论】BDE-209可引起原代培养新生鼠海马神经元细胞形态改变、细胞存活率下降,这与BDE-209有一定量效关系,NAC能改善BDE-209对海马神经元细胞形态及细胞存活率的影响,NAC的拮抗作用是与BDE-209和NAC的浓度及作用时间有关。第二部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209致新生鼠海马神经元氧化损伤的影响【实验目的】观察N-乙酰半胱氨酸对BDE-209致新生鼠海马神经元氧化损伤的影响。【材料与方法】1.原代培养7天的新生鼠海马神经元细胞,分成8组,即对照组和实验组,即对照组和实验组,对照组分为空白对照组(含有含1‰DMSO的培养液)和NAC对照组(含有0.1mmol/LNAC的培养液)。实验组为I组及II组,I组为BDE-209单独染毒组,其中分3个浓度小组,分别为10 ug/ml组、30 ug/ml组及50ug/ml组,II组为BDE-209与NAC同时作用组,也分为3个浓度小组,分别为10ug/ml组、30ug/ml组及50ug/ml, NAC浓度均为0.1mmol/L。染毒24小时后取细胞培养液进行检测。2.采用黄嘌呤氧化法测定SOD活力。3.采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。4.采用硝酸还原酶法测定NO含量。【结果】1.随浓BDE-209浓度的增加,在BDE-209单独染毒组及与NAC同时作用组中, SOD活力均有明显下降(P<0.05)。与NAC同时作用实验组中的SOD活力比BDE-209单独染毒组中的SOD活力高,并有明显差异性(P<0.05)2.在BDE-209单独染毒组中,随BDE-209浓度增加,MDA含量逐渐增加,30ug/ml组及50ug/ml组与对照组比较,均有明显差异性(P<0.05),在BDE-209单独染毒组及与NAC同时作用组之间比较,与NAC同时作用实验组中的MDA含量比BDE-209单独染毒组中MDA含量低,有明显差异性(P<0.05)。3.在BDE-209单独染毒组中,随BDE-209浓度增加,NO含量均有明显增加(P<0.05),三个浓度组间相比无明显差异性(P>0.05),在BDE-209单独染毒组及与NAC同时作用组之间比较,与NAC同时作用实验组中的NO含量比BDE-209单独染毒组低,有明显差异性(P<0.05)。【结论】BDE-209能引起海马神经元细胞氧化应激损伤,这可能是BDE-209的神经毒性的机制之一。而一定浓度的NAC能改善一定浓度的BDE-209引起的氧化损伤。第三部分BDE-209对原代培养新生鼠海马神经细胞整体DNA甲基化水平的影响【目的】检测BDE-209对原代培养新生鼠海马神经元细胞整体DNA甲基化水平,以探讨BDE-209对海马神经元细胞影响的作用机制。【材料与方法】1.原代培养7天的新生鼠海马神经元细胞分5组,即对照组和实验A、B、C组(含BDE-209浓度分别为10、30、50ug/ml),对照组又分为完全空白对照组及用1‰DMSO染毒的对照组。每组设3个平行样,实验重复3次。2.提取细胞DNA3.采取酶联免疫吸附法进行整体DNA甲基化定量分析【结果】BDE-209染毒后,均引起整体DNA甲基化水平下降,其中10ug/ml组及30ug/ml组与空白组对比,有明显差异性(P<0.05),10ug/ml组与DMSO对照组相比也有明显的差异性(P<0.05)。随浓度增BDE-209浓度增加,整体DNA甲基化水平有所增加,10ug/ml组与50ug/ml组相比也有明显差异性。(P<0.05)。【结论】一定浓度的BDE-209对海马神经元细胞的整体甲基化水平有一定影响。

全文目录

中文摘要  3-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-20
第一部分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209 致新生鼠海马神经元形态学改变的影响  20-33
  实验目的  20
  材料与方法  20-25
  结果  25-30
  讨论  30-33
第二部分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209 引起原代培养新生鼠海马神经元细胞氧化损伤的影响  33-44
  实验目的  33
  材料与方法  33-37
  结果  37-40
  结论  40-44
第三部分初步探讨BDE-209 对海马神经细胞DNA 甲基化水平的影响  44-52
  材料与方法  44-48
  结果  48
  讨论  48-52
参考文献  52-60
小结  60-61
缩略词表  61-62
综述  62-71
  参考文献  66-71
研究生在读期间已发表的文章  71-72
致谢  72-73

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