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稻瘟病菌SNARE蛋白的生物信息学分析及Mgsec22的功能研究

作　者: 宋雯雯
导　师: 郑小波
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 SNARE蛋白 膜泡融合 Mgsec22 几丁质 ROS
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


稻瘟病是影响全球水稻产量的重要病害,其病原真菌(Magnaporthe grisea)与水稻的互作系统已成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一,稻瘟病菌也是研究丝状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物。从全基因组水平分析研究稻瘟病菌重要基因的功能,可以加快对稻瘟病菌生物学特征及致病分子机制的认识,为培育长效抗病品种和制定稻瘟病持久控制策略提供了重要的理论依据。膜泡运输过程在所有的真核生物中是相当保守的,运输小泡与靶膜的融合过程中一类被称为SNARE(可溶性N一乙基顺丁烯二酞亚胺敏感性融合蛋白(NSF)连接蛋白受体蛋白)的整合蛋白是融合事件的关键因子。4个分别来自于不同亚家族Qa-,Qb-,Qc-及R-的SNARE蛋白形成四聚复合体介导膜泡融合过程。本文利用生物信息学手段,根据已经报道的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及米曲霉(Aspergillus oryzae)中的SNARE蛋白对稻瘟菌中可能存在的SNARE蛋白进行分析与预测,搜索到21个可能的SNARE蛋白。进一步分析了这些蛋白的二级结构及进化关系,将其分别归类至SNARE蛋白的四大亚家族中,同时对这四类蛋白分别进行蛋白序列比对分析,发现在稻瘟病菌中定位于内质网、高尔基体、内膜的SNARE蛋白是非常保守的。但是与酵母菌不同的是稻瘟病菌质膜上不存在结构相似、功能冗余的Qa-SNARE蛋白,这与A. oryzae一致。提示这些区别可能与酵母菌和丝状真菌极性生长、菌落形态及分泌功能上的差异有关。利用生物信息学方法在稻瘟病菌中预测并克隆出一个R-SNARE蛋白的编码基因命名为Mgsec22, Southern杂交结果显示该基因在稻瘟病菌基因组中为单拷贝。酵母突变体功能互补实验证明,尽管MgSEC22蛋白序列与酵母菌Sec22p在进化距离上相距较远,但在功能上具有相似性。进一步通过定向的基因敲除方法对其进行了初步的功能探索。结果显示,稻瘟病菌Mgsec22突变体与野生型相比气生菌丝稀薄,生长速率缓慢,几乎不产生分生孢子,致病力丧失；但该基因突变后对各种细胞壁胁迫因子的耐受性增强；CFW染色观察发现突变体细胞壁结构发生改变,几丁质含量明显提高。已证明活性氧与细胞分化、致病性等密切相关,本文中NBT染色观察到该基因的突变体菌丝中活性氧含量显著降低,进一步Real-time RT-PCR分析表明与活性氧产生相关的两个NADPH氧化酶基因Nox1和Nox2表达水平显著降低。过氧化物酶和漆酶在病原菌致病过程中起到重要作用,分光光度法测定发现突变体过氧化物酶和漆酶的活性均明显减弱。同时用各种染色实验及电镜扫描的方法检测液泡的形态及内吞作用,结果显示：突变体液泡的形态并未发生改变,但内吞作用明显受到影响。

全文目录


中文摘要  6-8ABSTRACT  8-10上篇 文献综述  10-33  第一章 SNARE蛋白及膜泡运输  11-23    1 SNARE作用的一般模式  11-12    2 SNARE蛋白的一般结构特征  12-15      2.1 大多数SNARE蛋白通过C端定位于质膜上  12      2.2 SNARE蛋白分为Qa-,Qb-,Qc-,R-四个亚家族  12-13      2.3 SNARE四聚复合体的成员分别来自于四个亚家族  13-14      2.4 SNARE蛋白按照N端区域分类  14-15    3 SNARE复合体作用机制  15-16    4 SNARE蛋白的调节因子  16-17      4.1 NSF与a-SNAP  16      4.2 Secl/Muncl8-like(SM)proteins  16      4.3 Munc13s  16-17    参考文献  17-23  第二章 SNARE蛋白家族的研究概况  23-33    1 哺乳动物中SNARE蛋白的研究进展  23    2 植物中SNARE蛋白功能研究  23-24    3 真菌中的SNARE蛋白  24-27      3.1 酵母菌中SNARE蛋白的研究  24-26      3.2 丝状真菌中SNARE蛋白的研究进展  26-27    4 稻瘟病菌中SNARE蛋白的研究意义  27-28    参考文献  28-33下篇 研究内容  33-82  第一章 稻瘟病菌SNARE蛋白家族的生物信息学分析  35-49    1 材料与方法  37      1.1 本文使用的数据库及软件  37    2 结果与分析  37-45      2.1 已报道的真菌中的SNARE蛋白  37-39      2.2 稻瘟病菌中的SNARE蛋白  39-45    3 讨论  45-47    参考文献  47-49  第二章 稻瘟病菌Mgsec22的功能研究  49-82    1 材料与方法  51-59      1.1 供试菌株及培养条件  51-52      1.2 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成  52      1.3 Mgsec22基因的克隆与蛋白序列分析  52-53      1.4 酵母互补载体构建和酵母功能互补分析  53-54      1.5 稻瘟病菌Mgsec22基因敲除突变体的获得  54-55      1.6 Mgsec22敲除转化子生长表型观测及产孢分析  55-56      1.7 突变体的致病性分析  56      1.8 Mgsec22基因突变对细胞壁完整性影响  56-57      1.9 菌丝体内活性氧水平检测  57-58      1.10 胞外漆酶及过氧化物酶活性的检测  58      1.11 突变体的液泡形态和内吞作用分析  58-59    2 结果与分析  59-76      2.1 Mgsec22生物信息学分析与预测  59-60      2.2 Mgsec22基因能够互补酵母突变体的功能  60-61      2.3 敲除载体的构建和获得  61-64      2.4 突变体菌丝生长的表型分析  64-65      2.5 Mgsec22基因敲除突变体存在严重的产孢缺陷  65-66      2.6 突变体丧失致病性  66-68      2.7 Mgsec22基因敲除突变体的细胞壁完整性发生改变  68-70      2.8 突变体菌丝内活性氧水平降低  70-72      2.9 胞外漆酶及过氧化物酶活性降低  72-73      2.10 突变体液泡功能缺陷  73-76      2.11 Mgsec22基因功能互补实验  76    3 讨论  76-78    参考文献  78-82附录1  82-85附录2  85-87攻读硕士学位期间发表的研究论文  87-89致谢  89

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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