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Caspase-3-siRNA预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

作　者: 郝晓斌
导　师: 郑世营
学　校: 苏州大学
专　业: 心胸血管外科学
关键词: RNA干扰 缺血再灌注损伤 细胞凋亡 基因沉默 心肌保护
分类号: R654.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:研究Caspase-3-siRNA预处理在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用与机制。方法: 78只雄性SD大鼠随机分为4组:即空白组、对照组、Scrambled-siRNA组和Caspase-3-siRNA组。Caspase-3-siRNA组和Scrambled-siRNA组:可逆性结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。在缺血前即刻、12h、24h分别采用水压法尾静脉注射Caspase-3-siRNA或Scrambled-siRNA预处理。对照组和空白组:建立动物模型同上,但空白组只穿线不阻断左冠状动脉前降支。采用上述相同方法尾静脉注射PBS缓冲液。各组左冠状动脉前降支阻断30 min后恢复再灌注,分别于再灌注2h、6h、12h、24h腹腔麻醉后腹主动脉采血检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,并在处死大鼠后取左室前壁心肌组织TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数。再灌注24h检测心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Caspase-3 mRNA表达水平,Western blot法检测Caspase-3蛋白表达水平。光学显微镜和透射电子显微镜观察再灌注后心肌组织结构的病理学变化。空白组只设24h一个时间点作为总体对照,检测指标同上。结果:(1)随着再灌注时间延长,除空白组外各组血清CK-MB及LDH水平逐渐升高。CK-MB在再灌注6h达到高峰,在12～24h逐渐下降,LDH在再灌注12h达到高峰,并且在再灌注24h仍维持在较高水平。在各时间点CK-MB和LDH水平,对照组和Scrambled-siRNA组高于Caspase-3-siRNA组,差异有统计学意义(P<0.05),而Scrambled-siRNA组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)TUNEL法检测结果显示,心肌细胞凋亡指数随着再灌注时间延长呈渐增趋势,再灌注12h达到高峰,至再灌注24h仍维持在较高水平。各时间点对照组和Scrambled-siRNA组凋亡指数明显高于Caspase-3-siRNA组(P<0.05或0.01),而Scrambled-siRNA组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Caspase-3-siRNA组SOD活性高于对照组和Scrambled-siRNA组(P<0.05),而MDA含量低于对照组和Scrambled-siRNA组(P<0.05)。SOD活性或MDA含量在对照组和Scrambled-siRNA组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)RT-PCR检测结果显示:Caspase-3-siRNA组Caspase-3 mRNA表达量低于对照组和Scrambled-siRNA组,差异有统计学意义(P<0.05),而Scrambled-siRNA组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。(5)Western blot检测结果显示:各组Caspase-3蛋白均有所表达,Caspase-3-siRNA组Caspase-3蛋白表达量低于对照组和Scrambled-siRNA组(P<0.05),表达明显受到抑制。(6)光镜显示空白组心肌纤维排列规则,细胞核结构完整,为正常心肌组织结构。对照组心肌纤维排列紊乱,细胞核不规则,胞浆着色深。间质明显水肿,有炎症细胞浸润。Scrambled-siRNA组心肌组织病理改变同对照组相似。Caspase-3-siRNA组心肌组织损伤相对较轻,心肌纤维排列较规整,间质水肿不明显,间质内可见少量炎症细胞浸润。(7)透射电镜显示空白组心肌细胞结构基本正常,肌原纤维平行排列,肌节清晰,线粒体形态一致呈椭圆形,细胞核结构正常,而对照组和Scrambled-siRNA组均可见肌原纤维排列紊乱、断裂。线粒体肿胀或固缩,嵴溶解,部分线粒体空化。细胞核内染色质边集,细胞质水肿明显。Caspase-3-siRNA组细胞结构损伤较轻,可见肌原纤维排列较规则,无明显溶解、断裂,线粒体形态接近正常,核内核仁清楚。结论:(1)心肌缺血再灌注损伤诱发了心肌细胞凋亡,Caspase-3参与了心肌细胞凋亡过程,并在这一过程中发挥了重要作用。(2)Caspase-3-siRNA预处理对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用,其机制可能与Caspase-3-siRNA特异的抑制Caspase-3基因表达,降低心肌细胞凋亡有关。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-9
前言  9-11
材料和方法  11-21
  1 材料  11-12
  2 方法  12-21
结果  21-30
  1、生化指标结果  21-22
  2、心肌细胞凋亡指数  22-24
  3、SOD 活性、MDA 含量  24-26
  4、心肌细胞Caspase-3 mRNA 的表达  26-27
  5、心肌细胞Caspase-3 蛋白的表达  27-28
  6、心肌组织病理学改变  28-30
讨论  30-37
  1、心肌缺血再灌注损伤的可能机制  30-34
  2、针对Caspase-3 基因RNA 干扰在心肌缺血再灌注损伤中的作用  34-37
结论  37-38
参考文献  38-41
综述  41-48
中英文缩写词表  48-49
攻读学位期间发表的论文  49-50
致谢  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 心脏血管和淋巴系外科学 > 体外循环及复苏术
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