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马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产

作　者: 吕东
导　师: 李国清
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 马铃薯甲虫 脯氨酸脱氢酶 转录异型体 RNA干扰
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


脯氨酸脱氢酶在昆虫中广泛存在,其功能是氧化脯氨酸生成丙氨酸、二氧化碳和水。许多研究表明,脯氨酸脱氢酶主要参与了昆虫重要神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的合成。但脯氨酸脱氢酶的另一功能——为鞘翅目昆虫的长距离飞行提供直接能量——一直没有受到应有的重视。本论文主要研究了重要鞘翅目害虫马铃薯甲虫的脯氨酸脱氢酶基因,解析马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶的基因结构,检测脯氨酸脱氢酶基因在马铃薯甲虫越冬前后表达丰度的差异,并在得到马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因干扰载体的基础上利用微生物发酵技术大量获得其dsRNA。本项研究对于更好的理解鞘翅目昆虫的长距离飞行及马铃薯甲虫的防治,具有重要意义。一、马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因全长的克隆根据其他昆虫的脯氨酸脱氢酶基因保守域序列设计兼并引物,扩增出马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的中心区段,结合5’RACE和3’RACE技术获得该基因的1个5’端序列和3个3’端序列,经序列拼接获得3个长度分别为2509bp、3076bp、3231bp的脯氨酸脱氢酶可变剪接体,在GenBank中登录号分别为GU355892、GU355893、GU355894,依次定名为脯氨酸脱氢酶基因转录异型体-1、2与3。序列分析结果表明,这3个可变剪接体均包含1个的开放阅读框,编码616氨基酸,其理论上的等电点PI=8.87,相对分子质量为7.07×104,聚类分析显示其与已报道的其它昆虫的脯氨酸脱氢酶基因具有较高的氨基酸序列同源性。二、马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的表达分析经过end-to-end PCR验证,进一步证实了马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶的3个转录异型体是确实存在的。以基因组DNA为对照,越冬前后的马铃薯甲虫cDNA为模板来研究脯氨酸脱氢酶的3个转录异型体在越冬前后表达丰度的差异。实验结果显示脯氨酸脱氢酶基因的3个转录异型体在越冬前都呈低水平表达,而脯氨酸脱氢酶基因转录异型体-1在越冬后优势转录表达。正常情况下,基因在3’UTR的序列越长,则其在细胞中的半衰期越短。这一结果表明,为了适应越冬后的长距离飞行需要,马铃薯甲虫通过缩短3’UTR序列长度的方式,达到延长脯氨酸脱氢酶mRNA半衰期进而来提高细胞中脯氨酸脱氢酶丰度的目的,以满足长距离飞行过程中高能量代谢的需求。三、sid-1基因cDNA片段的克隆与进化分析通过生物信息学手段对NCBI EST数据库中类sid-1基因进行预测,而后选取几种重要农业害虫(马铃薯甲虫,灰飞虱,褐飞虱)的类sid-1基因进行RACE PCR克隆。在褐飞虱中得到1个1137bp的5‘端序列和1个1328bp的3‘端序列,拼接得到2786bp的cDNA全长序列；在灰飞虱中得到1个792bp的5‘端序列和1个1766bp的3‘端序列,拼接得到2515bp的cDNA全长序列；在马铃薯甲虫中得到1个350bp的5‘端序列。褐飞虱与灰飞虱类sid-1基因拼接序列的End-to-end PCR分别得到片段大小为2594bp与2322bp的产物,产物的测序结果与拼接得到的序列是一致的。与其他物种类sid-1基因构建的聚类树状图表明拼接马铃薯甲虫类sid-1基因cDNA片段与已报道的其它昆虫的类sid-1基因具有较高的氨基酸序列同源性,且与赤拟谷盗距离最近,推测马铃薯甲虫也具有类sid-1基因,具备系统性RNA干扰的前提条件。四、应用微生物发酵技术获得马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因双链RNA的初步研究在昆虫中,已有通过喂食dsRNA干扰靶标基因来研究基因功能及达到植物保护目的的报道,而上述dsRNA一般要通过体外转录来合成,成本较高且不易保存,因此寻找经济、实用的dsRNA生产技术十分必要。将外源碱基序列通过载体转入基因工程菌,发酵增殖而获得大量目标dsRNA的方法是备选技术之一。本研究建立了利用大肠杆菌表达目的基因dsRNA的方法,并通过改变诱导子IPTG的浓度及诱导时间优化了发酵条件,初步肯定了此项技术应用于基因研究和植物保护的可能性。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-13缩略词  13-16第一章 文献综述  16-36  1 马铃薯甲虫是全球范围重要的鞘翅目害虫  16-23    1.1 马铃薯甲虫的起源  16-17    1.2 马铃薯甲虫的形态特征  17-18    1.3 马铃薯甲虫分布区及寄主植物的扩大  18-20    1.4 马铃薯甲虫的年生活史  20-23  2 马铃薯甲虫对我国的入侵  23-25    2.1 马铃薯甲虫在我国的扩散及其潜在风险  23-24    2.2 防控马铃薯甲虫扩散蔓延的对策措施  24    2.3 进一步防控马铃薯甲虫向东扩散蔓延的关键措施  24-25  3 马铃薯甲虫长距离飞行与脯氨酸脱氢酶  25-26  4 RNA干扰的研究概况  26-35    4.1 RNA干扰的研究的历史  26-27    4.2 RNA干扰的分子机理  27-32      4.2.1 转录后基因沉默机理  28      4.2.2 RNA干扰的起始阶段  28-29      4.2.3 RNA干扰的效应阶段  29      4.2.4 RNA解旋酶蛋白家族  29-30      4.2.5 沉默信号的传递与放大  30-31      4.2.6 蛋白质翻译水平  31      4.2.7 RNA介导的基因组甲基化  31-32    4.3 系统性RNA干扰  32-35      4.3.1 线虫中的系统性RNA干扰  32-33      4.3.2 蜜蜂中的系统性RNA干扰  33      4.3.3 果蝇中的细胞自主性RNA干扰  33-34      4.3.4 人类中的系统性RNA干扰  34      4.3.5 德国小蠊中的RNA干扰  34      4.3.6 蝗虫中的RNA干扰  34      4.3.7 其他昆虫中的RNA干扰  34-35  5 本文的研究目的  35-36第二章 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因全长克隆  36-52  1 材料与方法  36-45    1.1 供试昆虫  36-37    1.2 主要试剂和仪器设备  37      1.2.1 主要试剂  37      1.2.2 主要仪器设备  37    1.3 总RNA的提取  37-38    1.4 cDNA第一链的合成  38-39    1.5 5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA的合成  39-40      1.5.1 5'-RACE-Ready cDNA的合成  39-40      1.5.2 3'-RACE-Ready cDNA的合成  40    1.6 PCR引物  40-41    1.7 PCR反应  41-42      1.7.1 普通PCR反应体系及条件  41-42      1.7.2 RACE PCR反应体系及条件  42    1.8 常规分子克隆分子克隆  42-45      1.8.1 PCR产物的回收与纯化  42-43      1.8.2 连接反应  43      1.8.3 连接产物的转化、单克隆  43-44      1.8.4 重组质粒的提取及检测  44-45      1.8.5 序列测定与分析  45  2 结果与分析  45-50    2.1 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因片段的克隆  45-46    2.2 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶的RACE全长克隆  46-47    2.3 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶cDNA全长序列及聚类树状图的构建  47-50  3 讨论  50-52第三章 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因表达分析  52-60  1 材料与方法  53-55    1.1 end-to-end RT-PCR分别验证3个转录异型体  53    1.2 半定量用模板的准备  53-54      1.2.1 越冬前后马铃薯甲虫总RNA的提取  53      1.2.2 cDNA第一链的合成  53      1.2.3 越冬前后马铃薯甲虫DNA的提取  53-54    1.3 3个转录异型体在越冬前后表达丰度的差异  54-55  2 结果与分析  55-57    2.1 End-to-end PCR验证RACE结果  55    2.2 3个转录异型体在越冬前后表达丰度的差异  55-57  3 讨论  57-60第四章 类SID-1基因CDNA片段克隆与进化分析  60-68  1 材料与方法  61-62    1.1 实验材料  61    1.2 类sid-1基因的预测  61    1.3 RACE PCR克隆类sid-1基因  61    1.4 End-to-end验证拼接的RACE序列  61-62    1.5 进化分析  62  2 结果与分析  62-66    2.1 类sid-1基因的生物信息预测结果  62-63    2.2 RACE PCR结果  63-64    2.3 End-to-end PCR验证RACE结果  64-65    2.4 进化树分析  65-66  3 讨论  66-68第五章 应用微生物发酵技术获得马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因双链RNA初步研究  68-74  1 材料与方法  69-70    1.1 实验材料  69    1.2 双链RNA表达载体构建  69    1.3 双链RNA在大肠杆菌中的表达  69-70    1.4 双链RNA发酵条件的优化  70  2 结果与分析  70-72    2.1 dsRNA表达载体构建  70-71    2.2 双链RNA在大肠杆菌中的表达  71-72    2.3 双链RNA发酵条件的优化  72  3 讨论  72-74全文总结  74-76参考文献  76-86攻读硕士学位期间发表的论文  86-88致谢  88

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 薯类作物病虫害 > 马铃薯（土豆）病虫害
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