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几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆

作　者: 卢伟平
导　师: 李国清
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 马铃薯甲虫新型杀虫剂敏感性鱼尼丁受体保幼激素合成和代谢基因 RNA干扰
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata (Say)是北美洲、欧洲和亚洲的大部分国家马铃薯上最重要的食叶害虫。马铃薯甲虫于上世纪90年代从哈萨克斯坦入侵中国,现分布于新疆维吾尔自治区北疆的大部分县(市)。马铃薯甲虫在新疆北疆严重为害马铃薯和茄子。化学防治是一种经济、高效的治理措施。但马铃薯甲虫极易对任何种类的化学药剂产生抗药性。因此,监测其抗药性、分析其抗性机制十分重要和迫切。本文筛选出若干种对马铃薯甲虫毒杀活性较高、选择性强、环境污染轻的化学农药,克隆马铃薯甲虫中这些农药的靶标基因,为马铃薯甲虫的可持续控制奠定基础。1.几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒杀作用测定了三氟氯氰菊酯、阿维菌素、多杀菌素、氟虫腈、氯虫苯甲酰胺和除虫脲对乌鲁木齐市安宁渠试验地田间种群马铃薯甲虫成虫和4龄幼虫的触杀毒力以及成虫和2、3、4龄幼虫的胃毒毒力。氟虫腈、阿维菌素和多杀菌素可用于马铃薯甲虫成虫和幼虫的防治；氯虫苯甲酰胺更适于低龄幼虫期使用；而除虫脲的室内效果不佳,能否在田间应用仍需进一步评估。2.新疆北疆马铃薯甲虫对几种新型杀虫剂的敏感性采用点滴法于2009和2010年测定了新疆维吾尔自治区北疆7个田间种群对阿维菌素、多杀菌素、氟虫腈、氯虫苯甲酰胺、虫酰肼和除虫脲的敏感性。发现个别田间种群对阿维菌素和虫酰肼的敏感性年度间变化较大,而对多杀菌素、氟虫腈、氯虫苯甲酰胺和除虫脲的敏感性差异都在5倍以内。阿维菌素、多杀菌素和氟虫腈对这些田间种群均具有很好的毒杀效果,但是氯虫苯甲酰胺对田间种群成幼虫的触杀毒力差异显著。马铃薯甲虫对这些农药敏感性的差异与其田间种群对常规农药的抗性无关。以上结果表明这些药剂可用于北疆地区马铃薯甲虫防治及抗药性治理。3.氯虫苯甲酰胺的代谢及其靶标基因的克隆为了研究马铃薯甲虫对氯虫苯甲酰胺的代谢,测定了增效醚(PBO)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)对马铃薯甲虫4龄幼虫和成虫的增效作用。PBO在尼勒克和特克斯田间种群4龄幼虫对氯虫苯甲酰胺具有明显的增效作用,而在察布查尔田间种群成虫几乎无增效作用。而DEM和TPP在特克斯、尼勒克和察布查尔田间种群对氯虫苯甲酰胺均具无明显的增效作用。表明马铃薯甲虫主要通过细胞色素P450参与的氧化途径解毒氯虫苯甲酰胺。同时,利用转录组数据克隆了氯虫苯甲酰胺作用靶标鱼尼丁受体的20条基因片段,为随后的研究奠定了基础。4.保幼激素合成和代谢相关基因的克隆及RNAi结果克隆了保幼激素合成和代谢相关基因乙酰乙酰CoA硫解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、短链脱氢酶、法尼酸-O-甲基转移酶、柠檬酸裂合酶、腺苷高半胱氨酸酶、腺苷激酶、保幼激素酯酶、保幼激素环氧水解酶和保幼激素二醇激酶片段。将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、腺苷高半胱氨酸水解酶和保幼激素酯酶构建双链RNA表达载体(pET-2P-X)并转入大肠杆菌成功表达,其菌液处理的马铃薯叶片饲喂2龄幼虫后,含腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA的菌液表现出致死作用。

全文目录

中文摘要 8-10ABSTRACT 10-12第一章文献综述 12-40 1. 马铃薯甲虫的抗药性 12-14 2 马铃薯甲虫易产生抗药性的原因 14 3 合理使用农药治理或延缓马铃薯甲虫抗药性 14-20 3.1 农药的一般使用方法 15 3.2 农药的换用 15-16 3.3 农药的轮用 16-18 3.4 农药的混用 18-19 3.5 农药与增效剂的混用 19 3.6 致死剂量农药使用 19-20 4 采用避难所策略 20-23 4.1 间行施药法 21 4.2 周围施药法 21-22 4.3 混合施药法 22 4.4 挑治 22-23 5 新治理药剂的筛选 23-37 5.1 吡唑类杀虫剂氟虫腈 23-24 5.1.1 氟虫腈作用机理 23 5.1.2 氟虫腈的应用现状 23-24 5.2 阿维菌素 24-26 5.2.1 阿维菌素作用机理 24-25 5.2.2 阿维菌素的应用现状 25-26 5.3 多杀菌素 26-28 5.3.1 多杀菌素作用机理 26-27 5.3.2 多杀菌素的应用现状 27-28 5.4 氯虫苯甲酰胺 28-32 5.4.1 氯虫苯甲酰胺作用机理 28-29 5.4.2 鱼尼丁受体的结构及研究进展 29-31 5.4.3 氯虫苯甲酰胺的应用现状 31-32 5.5 虫酰肼 32-34 5.5.1 虫酰肼作用机理 32-33 5.5.2 虫酰肼的应用现状 33-34 5.6 除虫脲 34-35 5.6.1 除虫脲作用机理 34 5.6.2 除虫脲的应用现状 34-35 5.7 B.t.t.及其代谢产物 35-36 5.8 印楝素 36 5.9 敌草胺 36-37 6 昆虫保幼激素的研究进展 37-39 6.1 保幼激素的生物合成 37-38 6.2 保幼激素的代谢 38-39 7. 本研究的立题背景和意义 39-40第二章几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒杀作用 40-48 1 材料与方法 40-42 1.1 试虫采集和饲养 40 1.2 供试药剂和用具 40-41 1.3 测定及分析方法 41-42 2 结果与分析 42-46 2.1 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的触杀毒力 42-43 2.2 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫胃毒作用的差异 43-46 3 讨论 46-48第三章新疆北疆马铃薯甲虫对几种新型杀虫剂的敏感性 48-60 1 材料与方法 48-50 1.1 供试马铃薯甲虫 48-49 1.2 供试原药 49 1.3 测定及分析方法 49-50 2 结果与分析 50-57 2.1 马铃薯甲虫田间种群对阿维菌素的敏感性差异 50 2.2 马铃薯甲虫田间种群对多杀菌素的敏感性差异 50-52 2.3 马铃薯甲虫田间种群对氟虫腈的敏感性差异 52 2.4 马铃薯甲虫田间种群对氯虫苯甲酰胺的敏感性差异 52-53 2.5 马铃薯甲虫田间种群对虫酰肼的敏感性差异 53 2.6 马铃薯甲虫田间种群对除虫脲的敏感性差异 53-54 2.7 几种杀虫剂对成虫和幼虫触杀毒力的差异 54-55 2.8 几种杀虫剂敏感性差异与常用药剂抗性的相关性 55-57 3 讨论 57-60第四章氯虫苯甲酰胺的代谢及其靶标基因的克隆 60-74 1 材料和方法 61-68 1.1 试虫采集和饲养 61 1.2 主要化学农药、增效剂、试剂和仪器 61 1.3 增效实验方法 61-62 1.4 PCR扩增 62-65 1.4.1 总RNA的提取 62 1.4.2 cDNA第一链的合成 62-63 1.4.3 PCR引物设计 63-64 1.4.4 PCR扩增体系及条件 64-65 1.5 常规分子克隆 65-68 1.5.1 PCR产物的回收与纯化 65 1.5.2 连接反应 65-66 1.5.3 连接产物的转化和单克隆 66 1.5.4 重组质粒的提取及检测 66-67 1.5.5 序列测定与分析 67-68 2. 结果与分析 68-72 2.13 种酶抑制剂对氯虫苯甲酰胺毒杀活性的增效作用 68-69 2.1.1 对4龄幼虫的测定结果 68-69 2.1.2 对成虫的测定结果 69 2.2 马铃薯甲虫RyR基因的克隆及分析 69-72 2.2.1 马铃薯甲虫转录组全部RyR片段的扩增结果 69 2.2.2 马铃薯甲虫RyR基因片段的分析 69-72 3 讨论 72-74第五章保幼激素合成和代谢相关基因的克隆及RNAi结果 74-86 1 材料和方法 75-79 1.1 实验材料 75 1.2 主要试剂和仪器 75-76 1.3 试验方法 76-79 1.3.1 总RNA的提取 76 1.3.2 引物设计和PCR扩增 76-78 1.3.3 常规分子克隆 78 1.3.4 双链RNA表达载体构建 78-79 1.3.5 双链RNA在大肠杆菌中的表达 79 1.3.6 大肠杆菌中表达的dsRNA的饲喂 79 2. 结果与分析 79-83 2.1 保幼激素合成和代谢相关基因的克隆 79-81 2.2 双链RNA表达载体的构建和表达 81-82 2.3 含dsRNA菌液的饲喂结果 82-83 3 讨论 83-86参考文献 86-98附录一克隆证实的马铃薯甲虫RyR基因详情 98-100附录二克隆证实的马铃薯甲虫保幼激素合成和代谢相关基因详情 100-106攻读硕士学位期间发表的论文 106-108致谢 108

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