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球孢白僵菌过氧化氢酶BbcatA的功能分析

作　者: 陆江东
导　师: 冯明光
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 昆虫病原真菌球孢白僵菌抗氧化过氧化氢酶基因克隆酶活基因敲除抗逆性状毒力
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

作为经典的丝状昆虫病原真菌,球孢白僵菌因易于生产和环境友好等优点而在农林害虫防治中广泛应用。昆虫病原真菌抗逆的分子机理直接关系到生防菌剂的田间稳定性和应用效果。作为细胞抗氧化酶系的主要成员之一,过氧化氢酶在细胞抵抗活性氧自由基(ROS)胁迫过程中发挥着重要的作用。然而,目前罕见关于球孢白僵菌过氧化氢酶基因及其功能的研究报道,其对生防真菌抗逆生性状的贡献知之甚少。为此,本论文试从以过氧化氢酶基因为切入点,利用同源重组的方法敲除球孢白僵菌过氧化氢酶基因BbcatA,通过过氧化氢酶基因的缺失对菌株的抗逆力和毒力产生的影响,解析BbcatA的表达调控,为菌株改良提高提供了新的基因资源。主要研究内容及结果如下：BbcatA基因的克隆与表达调控通过序列比对及简并引物扩增,从球孢白僵菌Bb2860菌株基因组中克隆到单功能大亚基过氧化氢酶BbcatA基因,全长2235 bp,含1个60 bp的内含子。ORF全长2175 bp,编码724个氨基酸,编码蛋白质的分子量和等电点分别为80.7 kDa和6.8。该蛋白与其它丝状真菌的孢子特异性过氧化氢酶具有较高的同源性,与番茄叶霉病菌catA的同源性最高。BbcatA蛋白结构具有其它真菌过氧化氢酶结构中典型的血红素接合位点和氨基酸残基保守序列。氨基酸序列比对分析显示,BbcatA系CAT家族Ⅱ组的成员,属于单功能过氧化氢酶。BbcatA在菌丝中转录表达的前两天保持较高的水平,第3天急剧减少,在此后的4天里又逐步增强,但都达不到第二天的水平。在50 mM H2O2的刺激下,基因表达水平显著变化,胁迫1小时后的基因表达水平为空白对照的2.5倍；随着胁迫时间的的延长,BbCatA基因的表达水平进一步升高,胁迫3小时的表达水平为空白对照的4.5倍。结果表明,BbcatA参与H202氧化胁迫的防御。BbcatA基因敲除及突变株表型分析应用根癌农杆菌介导的遗传转化方法成功构建BbcatA的缺失突变株△BbcatA.在萌发实验中,△BbcatA的分生孢子对H202十分敏感,H2O2的半致死浓度LC5o比野生株下降42.2%。在紫外辐射与热胁迫实验中,△BbcatA的分生孢子对UV-B辐射的耐受力比野生株降低51.7%,对45℃热胁迫的半致死时间LT50比野生株降低37%。在生物测定中,△BbcatA分生孢子接种斜纹夜蛾二龄幼虫的致死率为59.8%,而野生株分生孢子的致死率为86.9%；△BbcatA对斜纹夜蛾二龄幼虫的LT50为6.4天,比野生株延长1.4天,表明BbcatA在较大程度上影响菌株的毒力。综上所述,本研究的主要创新点,一是系统研究了球孢白僵菌的过氧化氢酶基因BbcatA,分析了菌株不同阶段BbcatA的转录表达水平,以及在氧化胁迫条件下BbcatA转录表达水平的变化。二是通过根癌农杆菌介导的遗传转化实现了BbcatA的敲除,由此证明了BbcatA是影响菌株抗逆力和毒力的重要因子。这些结果有助于深化生防真菌抗逆性分子机理的认识。

全文目录

致谢  8-9
摘要  9-11
1 昆虫病原真菌抗逆生物学研究现状  11-23
  1.1 影响生防真菌制剂应用效果的环境胁迫  11-16
  1.2 真菌过氧化氢酶的研究现状  16-19
  1.3 丝状真菌基因工程研究方法  19-21
  1.4 展望  21-23
2 球孢白僵菌过氧化氢酶基因(BbcatA)的克隆  23-29
  2.1 材料  23
    2.1.1 菌株和载体  23
    2.1.2 试剂  23
  2.2 方法  23-26
    2.2.1 DNA提取  23-24
    2.2.2 RNA提取及反转录  24
    2.2.3 BbcatA基因克隆和分析  24-26
  2.3 结果  26-28
    2.3.1 BbcatA基因序列及编码蛋白的结构分析  26-27
    2.3.2 BbcatA蛋白的聚类分析  27-28
  2.4 讨论  28-29
3 球孢白僵菌BbcatA基因的表达调控  29-32
  3.1 材料  29
    3.1.1 菌株和载体  29
    3.1.2 试剂  29
  3.2 方法  29-30
    3.2.1 胁迫条件下BbcatA的表达调控分析  29-30
    3.2.2 生长发育阶段BbcatA的表达调控分析  30
  3.3 结果  30
  3.4 讨论  30-32
4 BbcatA基因敲除及突变子筛选鉴定  32-37
  4.1 材料  32
    4.1.1 菌株和载体  32
    4.1.2 试剂  32
  4.2 方法  32-34
    4.2.1 重组载体的构建  32
    4.2.2 根癌农杆菌感受态制备  32-33
    4.2.3 重组载体电击转化  33
    4.2.4 根癌农杆菌的培养及处理  33
    4.2.5 球孢白僵菌孢子悬液的制备  33
    4.2.6 农杆菌介导的真菌转化  33-34
    4.2.7 同源重组转化子PCR筛选及验证  34
    4.2.8 重组转化子DNA的Sourhern杂交验证  34
  4.3 结果与讨论  34-37
5 BbcatA敲除株的表型分析  37-43
  5.1 材料  37
    5.1.1 菌株及试剂  37
  5.2 方法  37-39
    5.2.1 蛋白提取物的制备及检测  37-38
    5.2.2 ΔBbcatA的表型测定  38-39
    5.2.3 数据处理及分析  39
  5.3 结果  39-41
    5.3.1 CAT体外酶活分析  39-40
    5.3.2 ABbcatA的抗逆性状变化  40-41
    5.3.3 ΔBbcatA的侵染毒力变化  41
  5.4 讨论  41-43
6 结语  43-44
参考文献  44-48
Summary  48-49

球孢白僵菌过氧化氢酶BbcatA的功能分析

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