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鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析

作　者: 苏志新
导　师: 陆承平；严亚贤
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽致病性大肠杆菌(APEC) 分离鉴定系统进化群药敏实验毒力基因致病性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)能引起禽类的心包炎、肝周炎、腹膜炎、脐炎等,有时也能引起急性败血症。近年来对APEC的报道日益增多。APEC的血清型众多,不同地区的分布比例有很大差异,很多菌株对常用药物具有耐药性,且不同地区分离菌株的耐药性存在显著差异。因此,对某一地区进行APEC的分离鉴定、分子流行特征分析,及药物敏感性的检测,将会对养殖场控制APEC具有很重要的指导意义。本试验对上海某养鸡场的APEC进行了分离鉴定,并测定了分离菌株的主要毒力相关基因的分布特征,分析了分离菌株的系统进化群,以期发现分离株所携带的毒力因子与致病性之间的相关性,为揭示APEC的致病机制积累研究基础。2009年12月到2010年5月期间,从上海某养鸡场具有临床症状,已经发病或将死亡的病鸡采集样本。剖解过程中病鸡呈现大肠杆菌病典型症状如心包炎、肝周炎、腹膜炎、脐炎等,采集的样本包括病鸡的各内脏组织和肠道粪便。将样本通过麦康凯培养基培养,选择典型菌落特征接种LB液体培养基,然后分别采用单一PCR和多重PCR对菌株进行鉴定。根据大肠杆菌16S rRNA特异性基因的检测,获得80株禽源大肠杆菌,其中从病鸡的器官组织中分离到52株APEC,从病鸡的粪便和肠道分离得28株大肠杆菌,为禽粪便中共生的大肠杆菌(Avian fecal commensal Escherichia coli, AFEC).52株APEC分离株中,心脏分离有31株(38.75%),肾脏分离有13株(16.25%),肝脏分离有7株(8.75%),肺脏分离有1株(1.25%)。根据APEC的毒力基因iroN、ompT、hlyF、iss和iutA的序列特征设计特异性引物,通过PCR测定80株分离菌株中五个基因的分布特征,结果共有59株携带所有的5个毒力基因。来自器官组织的52株APEC平均每株携带4.7个基因,有49株同时携带这5个毒力基因,占APEC分离株的94.23%(49/52)；28株AFEC分离株中,平均每株携带2.1个基因,共有10株携带所有的5个毒力基因,占AFEC分离株的37.51%(10/28),本方法能区出APEC菌株49株和AFEC菌株18株,共67株,占分离菌株的83.75%(67/80)。在此基础上,本文建立了大肠杆菌16S rRNA、hlyF、iss、iutA四个基因的多重PCR检测方法,特异性好,检测敏感性为3×106CFU/ml,可用来快速鉴定APEC。为了进一步揭示分离菌株的遗传起源和分子特性,采用快速的分子分群方法,通过PCR特异性扩增大肠杆菌chuA基因、yjaA基因和大肠杆菌DNA片段TspE4.C2,对所分离的菌株进行系统进化群分析。结果所分离的52株APEC菌株中,A群有13株,占25.00%(13/52),B1群有31株,占59.61%(31/52),B2群有3株,占5.77%(3/52),D群有5株,占9.62%(5/52)。28株AFEC分离株中,A群有9株,占32.14%(9/28),B1群有15株,占53.57%(15/28),B2群有3株,占10.71%(10/28),D群有6株,占7.50%(6/28)。表明上海某养鸡场中APEC和AFEC中均以B1群的菌株为优势进化群,这对研究APEC的生态分布和遗传进化,以及养鸡场的防控均有一定的参考价值。考虑到APEC通常含有很多不同的毒力相关基因,为进一步分析分离菌株的毒力基因的分布特征,再选择另外11个毒力相关基因,采用PCR的方法进行检测。其中4个为非侵袭相关基因,即tsh、mat、iucD、traT; 7个为侵袭相关基因,即fimC、cvi/cva、ompA、gimB、ibeA、yijP、aslA、结果表明,除gimB和ibeA基因全部分离株均为阴性外,其他基因都有不同程度的分布。52株APEC分离株的基因携带情况为：tsh基因21.15%(11/52),mat基因100%(52/52),iucD基因92.21%(28/52),traT基因57.69%(30/52),fimC基因98.08%(51/52),cvi/cva基因25.00%(13/52),ompA基因90.04%(47/52)。28株AFEC分离株的基因携带情况为：tsh基因17.86%(5/28),mat基因96.43%(27/28),iucD基因57.14%(16/28),traT基因46.42%(13/28),fimC基因92.86%(26/28),cvi/cva基因17.86%(5/28),ompA基因100%(28/28)。通过比较发现,APEC菌株的iucD基因阳性率比AFEC菌株高35.17%,aslA基因阳性率低25%,差异较明显,而其它基因的差异在本实验中并不明显。为了进一步了解分离菌株对药物敏感性的差异,采用纸片扩散法检测分离菌株对15种常用药物的敏感程度。试验结果表明,15种药物中,分离菌株对菌必治、丁胺卡那霉素、左氟沙星三种药物的敏感比例都在50%以上,其中,菌必治最敏感。分离菌株对强力霉素、复方新诺明、阿莫西林、恩诺沙星等均严重耐药。52株APEC分离株中,对菌必治敏感的有42株,占80.77%(42/52),耐药的有7株,占13.46%(7/52),28株AFEC分离株中,对菌必治敏感的有20株,占71.43%(20/28),耐药的有9株,占32.14%(9/28)。APEC菌株和AFEC菌株对这15种药物的敏感程度分布相似,没有太显著的差异。药敏试验结果可以指导在临床治疗过程中的抗菌药物的选择。毒力基因的分布差异是否与分离菌株的致病性直接相关是APEC研究中最为关注的焦点,选择分离菌株中毒力基因分布有明显差异的A31和A74的进行致病性比较,A74菌株比A31菌株多含有3种侵袭相关基因(cva、ompA、aslA)和一种非侵袭相关基因(tsh),将分离株A31和A74培养至对数生长期,分别进行小鼠毒力试验,结果发现,A31菌株和A74菌株的对小鼠的LD50分别为6.46×108CFU/ml和8.62×105CFU/ml,小鼠的LD50差异明显,说明A74菌株的致病能力比A31菌株要强,这为进一步研究APEC的致病机制提供理论基础。

全文目录

摘要 6-9ABSTRACT 9-12第一篇文献综述 12-24 第一章禽致病性大肠杆菌的研究进展 12-20 1 病原学 12-13 2 流行病学 13 3 致病机理 13 4 禽致病性大肠杆菌的毒力因子 13-18 4.1 粘附素(Adhesin) 14-15 4.2 摄铁系统(Ferric uptake regulator,Fur) 15 4.3 溶血素(Haemolysin) 15-16 4.4 抗血清存活因子 16-17 4.5 毒素 17-18 4.6 其它的毒力因子 18 5 APEC药物敏感性 18-19 6 本项目研究意义 19-20 参考文献 20-24第二篇试验内容 24-58 第二章上海某养鸡场APEC的分离鉴定与多重PCR快速检测方法的建立 24-36 1 材料和方法 25-28 1.1 病料来源 25 1.2 培养基和主要试剂 25 1.3 细菌的分离和纯化 25 1.4 大肠杆菌的鉴定 25-26 1.5 分离临床菌株的5个毒力基因的检测 26-28 2 结果 28-34 2.1 大肠杆菌临床菌株的分离 28-29 2.2 iroN、ompT、hlyF、iss和iutA五个毒力基因的PCR检测结果 29-33 2.3 大肠杆菌16S rRNA、hlyF、iss、iutA四个基因的四重PCR检测结果 33-34 3 小结与讨论 34-35 参考文献 35-36 第三章分离菌株的系统进化群分析和毒力基因分布特征 36-46 1 材料和方法 37-40 1.1 菌株来源 37 1.2 实验材料 37 1.3 系统进化群分析 37-38 1.4 APEC 11个毒力相关基因的检测 38-40 2 结果 40-42 2.1 分离菌株的系统进化群分析结果 40 2.2 分离菌株的11个毒力基因的检测结果 40-41 2.3 不同系统进化群的分离菌株的毒力基因分布 41-42 3 小结与讨论 42-44 参考文献 44-46 第四章分离菌株的药敏试验和对小鼠的致病性研究 46-58 1 材料与方法 47-49 1.1 菌株和实验动物 47 1.2 实验材料 47 1.3 80株分离菌株的15种药物的纸片药敏试验 47-48 1.4 A31与A74菌株的生长曲线的测定 48 1.5 A31菌株与A74菌株的小鼠致病性试验 48-49 2 结果 49-55 2.1 分离菌株的15种药物的纸片药敏试验结果 49-53 2.2 A31菌株与A74菌株的生长曲线 53-54 2.3 致病性试验结果 54-55 3 小结与讨论 55-57 参考文献 57-58全文总结 58-60致谢 60

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