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溶藻弧菌毒力相关基因的检测与保藏方法的研究
作 者: 韩佳丽
导 师: 鲁义善
学 校: 广东海洋大学
专 业: 水产养殖
关键词: 溶藻弧菌 毒力因子 荧光定量PCR 菌种保藏
分类号: S943
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 16次
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内容摘要
溶藻弧菌对宿主的致病性与溶藻弧菌产生的各种毒力因子息息相关。本研究以溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因(Collagenase)、碱性丝氨酸蛋白酶基因(Alkaline serine exoprotease,AspA)、鞭毛丝蛋白基因(FlaA)、铁摄取调节基因(fur)、毒力调控基因toxR以及toxS作为目的基因,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对不同保藏方法其表达量进行检测。选取实验室保存的8株溶藻弧菌为对象,提取其总RNA为模板,根据GenBank上的全序列设计特异性引物,以16S基因为内参照,研究了collagenase、AspA、FlaA、fur、toxR以及toxS基因的表达量。再分别用这8株菌对罗非鱼进行传统攻毒实验,观测其致死率,分析其毒性强弱。结合两部分研究结果发现,溶藻弧菌的collagenase、AspA、FlaA、toxR以及toxS基因的表达量与溶藻弧菌的毒力具有相关性;而fur基因则与溶藻弧菌的毒力不具有相关性。采用斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、生理盐水保藏法以及甘油液保藏法对实验室同一株溶藻弧菌强毒株进行为期一年的保藏,再用实时荧光定量PCR对其各毒力相关基因的表达量进行检测。分析发现,本研究所采取的四种保藏手法都能较好的保持菌种的存活率以及遗传稳定性,其中斜面低温保藏法效果尤为明显。另外,研究还发现铁摄取调节基因(fur)和毒力调控基因toxS在不同的保藏手法下表达量始终保持相对稳定。本论文的研究成果为探讨溶藻弧菌毒力的荧光定量PCR检测方法的应用奠定了坚实的基础,完善了溶藻弧菌毒力检测的分子手段,有效地提高了溶藻弧菌毒力检测技术的速度与准确性。同时,本文通过对菌种保藏方法的研究,为实验室如何更好地保藏菌种提供了重要的理论指导,为菌种的进一步研究提供优质的实验材料。
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全文目录
摘要 6-7Abstract 7-101 前言 10-19 1.1 溶藻弧菌的概况 10-16 1.1.1 溶藻弧菌的生物特性 10 1.1.2 溶藻弧菌的致病性 10-11 1.1.3 溶藻弧菌的毒力因子 11-16 1.2 细菌检测手段 16-17 1.2.1 菌种鉴定 16 1.2.2 实时荧光定量PCR 检测 16-17 1.3 菌种保藏手段 17-18 1.4 实验目的与意义 18-192 溶藻弧菌毒力基因表达与其毒力的相关性 19-39 2.1 引言 19 2.2 材料 19-21 2.2.1 菌株和实验用鱼 19 2.2.2 主要试剂、工具酶及试剂盒 19-20 2.2.3 主要溶液 20 2.2.4 仪器 20-21 2.3 实验方法 21-28 2.3.1 溶藻弧菌的菌种鉴定 21-24 2.3.2 Trizol 法提取弧菌RNA 24 2.3.3 RNA 的纯化与稀释 24-25 2.3.4 第一链cDNA 合成 25 2.3.5 特异性引物 25-27 2.3.6 实时荧光定量PCR 27-28 2.3.7 传统攻毒实验 28 2.4 结果 28-37 2.4.1 16SrRNA 菌种鉴定结果 28-34 2.4.2 溶藻弧菌RNA 的提取 34 2.4.3 反转录第一条链 cDNA 34-35 2.4.4 特异性引物鉴定 35-36 2.4.5 荧光定量PCR 检测结果 36 2.4.6 攻毒实验结果 36-37 2.5 讨论 37-393 不同保藏手段对溶藻毒力基因表达量的影响 39-46 3.1 引言 39 3.2 材料 39-40 3.2.1 菌株 39 3.2.2 主要试剂、工具酶及试剂盒 39 3.2.3 主要溶液 39-40 3.2.4 仪器 40 3.3 实验方法 40-41 3.3.1 菌种保藏 40 3.3.2 Trizlo 法提取溶藻弧菌的RNA 40-41 3.3.3 第一链cDNA 合成 41 3.3.4 荧光定量PCR 41 3.4 结果 41-44 3.4.1 荧光定量PCR 结果 41-44 3.5 讨论 44-464 结论 46-47 4.1 溶藻弧菌毒力相关基因与其毒力的相关性 46 4.2 不同菌种保藏手段对溶藻弧菌毒力相关基因表达量的影响 46-47参考文献 47-55致谢 55-56作者简介 56-57导师简介 57
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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