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内容摘要

研究背景胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)肿瘤最常见的肿瘤,有报道其每年发病率高达7／10万人,占到了70岁之前因患癌症病人死亡的7%。该类肿瘤特征是进行性生长,广泛血管生成,复发,弥散侵犯周围组织并导致神经功能障碍。目前对于胶质瘤患者多采取综合治疗,包括手术切除、放疗和化疗。在过去的20多年,神经外科技术、放疗、化疗虽然取得了很大进展,但对于胶质瘤仍然是姑息性治疗和处理,并且预后十分差。有报道称,胶质瘤病人6月存活率42.4%,1年存活率17.7%,2年存活率仅为3.3%。因此,仍需努力寻求新的治疗方案。深入探求胶质瘤的发病基因机制和分子生物学特征而寻求新的治疗方法成为医学研究的必要。p53被认为是基因组的管家。当细胞受到内部或外部的应急刺激时(譬如DNA损伤,炎症,缺氧等),p53即开始激活并转录通过控制细胞周期、衰老或促进细胞凋亡而阻止细胞向恶性转化。而且促进细胞凋亡是p53抑制肿瘤的重要作用。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体,属于酪氨酸激酶受体ErbB家族,激活的EGFR可通过Ras和P13K两种信号途径促进细胞增殖。大量研究表明EGFR信号途径在胶质瘤发生发展过程中发挥着关键作用,并且通过阻滞EGFR信号途径是治疗胶质瘤的新策略,有用单克隆抗体[如曲妥单抗(Trastuzumab)]细胞表面封锁或用小分子药物(譬如ZD-和OS-774)封锁细胞内信号途径等诸多方法,为胶质瘤患者带来了新希望。本研究以肿瘤抑制因子p53和表皮生长因子受体EGFR为切入点,结合本团队新发现的一种与AD发病相关的信号通路,探讨胶质瘤发病机制及寻求增强治疗效果的新途径。有研究认为(http://baike.qiji.cn/Detailed/5102.html),缓慢生长且病程较久的脑肿瘤可以诱发阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD,又称老年痴呆),其与肿瘤类型及发生部位密切相关,一般认为海马区是AD病变的重要部位,如若脑肿瘤生长在海马附近,且肿瘤生长速度快、体积大,就更易引起AD；另一方面,临床上值得注意的现象是,已患AD的病例观察到很少并发脑肿瘤,此现象提示：与AD发生机制相关的信号通路是否参与抑制脑胶质瘤发生发展?众所周知,AD的主要病理标志之一是p淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)酶解生成的细胞外p淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积,而伴随Aβ的生成,APP同时释放其羧基段的细胞内末端(APP intracellualr domain, AICD)。已有研究表明,AICD通过APP/AICD/p53或APP/AICD/EGFR(epidermal growth factor receptor, EGFR)等信号途径,可以增强细胞凋亡和发挥肿瘤抑制效应；特别是本团队最新发现,细胞粘连分子TAG-1 (transient axonal glycoprotein-1,瞬变轴突糖蛋白1)可作为APP的配体、增强APP胞内段AICD的释放并参与AD的发生发展(研究结果已发表在《Nature Cell Biology》,2008.10 (3):283-94),那么与TAG-1诱发信号通路相关的某些信号途径(如TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR)是否也与胶质瘤的发生发展有联系?TAG-1启动的这些信号通路在胶质瘤发生发展过程中的作用怎样?目前尚未得知。本研究以抑癌基因p53和EGFR为切入点,以TAG-1/APP/AICD/p53及TAG-1/APP/AICD/EGFR信号通路为主线,探讨TAG-1对胶质瘤细胞系U251细胞的活力及其对AICD、p53和EGFR基因表达的影响,以探寻胶质瘤治疗的可能新途径。目的研究TAG-1对U251细胞生长活力、AICD、p53和EGFR基因表达变化的影响,从分子信号途径寻求治疗临床胶质瘤的新措施。方法以MTT法检测不同浓度TAG-1对U251细胞活力影响；免疫荧光细胞化学法观察U251细胞APP的表达情况及APP在U251细胞膜分布；TUNEL法从形态学上检测TAG-1对U251细胞凋亡变化的影响；Real-time PCR检测TAG-1对U251细胞AICD、p53和EGFR基因表达的调控及变化。结果APP广泛表达于U251细胞膜和树突,而胞体内APP荧光染色不是十分强烈；经不同浓度的TAG-1作用一定时间后,TAG-1没有抑制U251细胞的生长,相反表现出一定的促生长效应,且各组间差异无统计学意义(P=0.429)；在TAG-1浓度为10μg/ml时,U251细胞通过TUNENL形态学凋亡检测没有发现明显的凋亡细胞；而在10μg/ml TAG-1的作用下,与对照组(0μg／m1)相比,AICD、p53和EGFR基因表达都有不同程度的增加。讨论与我们预料的不同,实验结果提示TAG-1没有抑制U251细胞生长,反而在一组实验中,通过MTT检测显示,TAG-1可能促进细胞生长；利用TUNEL凋亡检测方法检测经TAG-1作用的U251细胞,亦没有观察到凋亡细胞；且相对于对照组(0μg/ml of TAG-1), p53、EGFR、AICD等基因都有增高。以上提示,我们推测TAG-1可能通过其他不同的信号途径发挥作用而诱导EGFR过量表达,进而促进U251细胞增殖；p53基因的表达上调可能为肿瘤细胞增殖的应急反应,也就是说,过量增殖的肿瘤细胞诱导了p53基因表达上调。因此,阻止TAG-1信号途径可能是治疗肿瘤的措施之一。本实验首次报道TAG-1对U251细胞AICD、p53、EGFR基因的作用,提示TAG-1未有通过TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR信号途径诱导细胞凋亡,但TAG-1在胶质瘤增殖中可能发挥重要作用。可以理解为：分子信号途径不是直线式的,一种细胞促发物可能激活不同的信号网络,并且在多水平上发挥作用；且任何一种分子的作用都依赖于细胞类型和细胞状态,受细胞微环境中其他因素的影响,所以用不同的刺激物或不同的细胞系针对同一信号途径亦会得到不同的结果和现象。有关TAG-1影响EGFR基因表达的机制及TAG-1/APP等信号途径在细胞增殖中的作用机制和其在胶质瘤治疗中的意义尚需下一步深入研究。结论1、与TAG-1并未通过TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR等信号途径诱导细胞凋亡而抑制胶质瘤生长和增殖,相反,TAG-1可能通过诱导其他信号途径参与胶质瘤细胞发生发展进而促进胶质瘤细胞增殖；2、TAG-1可能通过其他不同的信号途径诱导EGFR基因表达增加,进而促进U251细胞增殖；p53基因表达上调可能是肿瘤细胞增殖的应激反应,即过量增殖的肿瘤细胞诱导p53基因表达上调,而p53基因突变及其表的蛋白大部分失活未能诱导细胞凋亡；阻止TAG-1等信途径可能是治疗脑肿瘤的措施之一

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摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-17
TAG-1对U251细胞活力及AICD、p53、EGFR基因影响  17-34
  1 实验材料  17-19
  2 实验方法  19-28
  3 实验结果  28-29
  4 讨论  29-34
附图  34-39
参考文献  39-44
综述  44-56
全文总结  56-58
中英文缩略词对照表  58-59
攻读硕士学位期间发表文章  59-60
致谢  60-63
统计学审稿证明  63

TAG-1对U251细胞活力的影响及相关基因调节机制研究

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