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PRRSV感染诱导内质网应激反应的分子机制研究

作　者: 刘苏燕
导　师: 方六荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 内质网应激 未折叠蛋白反应 细胞凋亡
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


内质网是病毒蛋白折叠、装配与成熟的场所,病毒感染细胞后常导致以未折叠蛋白大量积累为特征的内质网应激。发生应激后,为了维持内质网的稳态和功能,细胞随即启动未折叠蛋白反应(UPR),通过抑制病毒蛋白的合成、降解驻留在内质网的病毒蛋白量或诱导促折叠伴侣分子表达等,应对病毒感染导致的内质网应激。而病毒为了达到在细胞内有效复制与感染的目的,则通过对UPR的精细调控消除对其增殖的不利因素,营造有利于其复制与增殖的微环境,同时病毒还通过调控UPR抑制干扰素(IFN)等天然抗病毒分子的表达,从而逃避机体的免疫抑制作用,最终达到致病的目的。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征的猪繁殖与呼吸综合征,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,尽管在过去的20年间人们对PRRSV进行了广泛的研究,取得了一系列有重要意义的结果,但仍难以揭开这种“神秘病”的神秘面纱,尤其在病毒的感染机制和免疫机理等基础研究方面,人们还知之甚少。鉴于UPR在病毒的感染与免疫逃避中的重要作用,本研究主要针对PRRSV感染后诱导内质网应激反应的分子机制进行了深入探讨,以期进一步揭示PRRSV的感染与致病机理。主要研究内容包括：1. PRRSV感染诱导内质网应激反应通过电镜观察发现PRRSV感染后的Marc-145细胞的内质网发生明显的肿胀；同时利用SYBR Real-time RT-PCR检测PRRSV感染后不同时间内质网应激反应的两种标志分子GRP78和GRP94的表达情况,也发现PRRSV感染能显著上调伴侣分子GRP78和GRP94的表达,并呈时间依赖性。说明PRRSV感染后能诱导内质网应激反应。2. PRRSV感染激活PERK途径通过Western blotting检测PERK的直接作用底物eIF2α的磷酸化,发现在PRRSV感染后6h就能检测到磷酸化的eIF2α,36h达到最高水平,48h有所下降,而总的eIF2α蛋白含量没有明显变化。说明PRRSV感染早期就能通过磷酸化的eIF2α抑制蛋白的翻译,激活PERK途径。对eIF2α下游分子检测发现,当PRRSV持续感染,细胞不能通过UPR克服应激时,磷酸化的eIF2α通过激活转录因子ATF4诱导下游基因CHOP和GADD34的表达上调,由CHOP基因介导内质网相关的细胞凋亡,同时由GADD34基因对UPR进行负反馈调节。3. PRRSV感染激活IRE1/XBP1途径RT-PCR和酶切检测发现PRRSV感染Marc-145细胞后,IRE1的唯一作用底物XBP1表达上调,且多以XBP1s剪切形式存在。利用SYBR Real-time RT-PCR和双荧光素酶报告系统检测发现,XBP1s的靶基因如介导内质网相关性降解的蛋白EDEM和UPR负反馈调节蛋白p58IPK以及仅依赖于XBP1s识别的UPRE元件在PRRSV感染后的Marc-145细胞中均有上调。说明PRRSV感染激活IRE1/XBP1途径。4. PRRSV感染不激活ATF6途径利用荧光素酶报告基因检测]PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间转录活化因子ATF6的表达,发现其未被激活。进一步对其靶基因进行分析发现,能够被ATF6识别的ERSE元件以及由ATF6诱导表达的一些重要内质网伴侣蛋白PD、ERp57、calnexin、calreticulin在PRRSV感染后的Marc-145细胞中均没有显著变化。说明PRRSV感染不激活ATF6途径。5. PRRSV ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5编码的蛋白参与UPR调控将PRRSV各结构蛋白基因的真核表达质粒与荧光素酶报告质粒XBP1-Fluc共转染Hela细胞,通过对XBP1s的荧光素酶活性检测发现PRRSV ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5编码的蛋白可以诱导XBP1s的表达,说明这几个蛋白参与PRRSV诱导的UPR的调控。经分析,这些蛋白都含有糖基化位点,而蛋白质的糖基化抑制可以激活内质网应激,因此我们推测,含有糖基化位点的蛋白更容易诱导内质网应激反应。6. PRRSV感染通过CHOP诱发细胞凋亡CHOP是内质网凋亡途径的关键细胞因子,在证实PRRSV感染能够诱导CHOP基因的表达后,对其诱导细胞凋亡的机制进行了进一步的研究,发现PRRSV感染后能上调凋亡标志基因caspase3,9的表达,而当CHOP的表达被siRNA抑制时,caspase3,9的表达也显著下调,说明PRRSV感染能够通过CHOP诱发细胞凋亡。对PRRSV在细胞中的增殖检测发现,当CHOP基因被抑制后,PRRSV的增殖显著增强,说明CHOP可以通过促进细胞凋亡来抑制PRRSV在宿主机体内的复制与增殖,是一种宿主自发的保护性反应。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略语表(Abbreviation)  11-13
第1章 文献综述  13-19
  1.1 内质网应激反应的概述  13-14
    1.1.1 引起ERS的因素  13
    1.1.2 ERS的表现  13-14
  1.2 内质网伴侣分子  14-15
  1.3 未折叠蛋白反应的途径  15-17
    1.3.1 PERK途径  15-16
    1.3.2 IRE1/XBP1途径  16-17
    1.3.3 ATF6途径  17
  1.4 内质网应激反应和细胞凋亡  17-18
  1.5 内质网应激反应和疾病  18-19
第2章 研究目的与意义  19-20
第3章 材料与方法  20-35
  3.1 试验材料  20-23
    3.1.1 毒株、细胞与菌株  20
    3.1.2 载体与质粒  20
    3.1.3 工具酶及主要试剂  20-21
    3.1.4 培养基与抗生素及其配制  21
    3.1.5 干扰素及抗体  21-22
    3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制  22-23
  3.2 实验方法  23-35
    3.2.1 PRRSV的增殖  23
    3.2.2 内质网的电镜观察  23-24
    3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  24
    3.2.4 连接产物的转化  24
    3.2.5 质粒的制备与鉴定  24-26
    3.2.6 质粒转染(罗氏转染试剂介导转染法)  26
    3.2.7 双荧光素酶检测实验  26
    3.2.8 Western blotting检测目的蛋白在真核细胞中的表达  26-28
    3.2.9 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定  28
    3.2.10 细胞、感染病毒的细胞样品总RNA的提取  28-29
    3.2.11 XBP1 RT-PCR检测  29-30
    3.2.12 PCR产物纯化  30-31
    3.2.13 Pst Ⅰ限制性内切酶酶切反应  31
    3.2.14 PCR产物或酶切产物的电泳检测  31
    3.2.15 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR  31-32
    3.2.16 相对mRNA表达水平的计算  32
    3.2.17 统计学方法  32-33
    3.2.18 本研究中所用到的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR引物  33-34
    3.2.19 caspase活性检测方法  34-35
第4章 结果和分析  35-48
  4.1 PRRSV感染能够诱导内质网应激反应  35-36
    4.1.1 PRRSV感染Marc-145细胞引起内质网肿胀  35
    4.1.2 PRRSV感染激活内质网伴侣蛋白GRP78、GRP94的表达  35-36
  4.2 PRRSV感染激活PERK途径  36-39
    4.2.1 PRRSV感染引起eIF2α的磷酸化  36-37
    4.2.2 PRRSV感染激活ATF4的表达  37-38
    4.2.3 PRRSV感染激活CHOP的表达  38-39
    4.2.4 PRRSV感染激活GADD34的表达  39
  4.3 PRRSV感染激活IRE1/XBP1途径  39-43
    4.3.1 PRRSV感染诱导XBP1的剪切  39-41
    4.3.2 PRRSV感染激活p58~(IPK)的表达  41-42
    4.3.3 PRRSV感染激活内质网降解相关蛋白EDEM的表达  42-43
    4.3.4 PRRSV感染激活UPRE元件  43
  4.4 PRRSV感染不能激活ATF6途径  43-45
    4.4.1 PRRSV感染不激活ATF6的表达  43-44
    4.4.2 PRRSV感染不激活ERSE元件  44
    4.4.3 PRRSV感染不激活伴侣蛋白CNX、CRT、ERp57、PDI的表达  44-45
  4.5 参与诱导内质网应激的PRRSV结构蛋白的确定  45-46
  4.6 PRRSV通过CHOP基因介导细胞凋亡的研究  46-48
    4.6.1 PRRSV可以通过CHOP激活caspase  46-47
    4.6.2 Marc-145细胞通过CHOP介导的凋亡抑制PRRSV的释放  47-48
第5章 讨论与结论  48-53
  5.1 讨论  48-52
    5.1.1 PRRSV感染激活PERK途径和IRE1/XBP1途径的机制  48-50
    5.1.2 PRRSV通过调控UPR促使细胞死亡的机制  50
    5.1.3 PRRSV诱导细胞内质网相关凋亡的机制  50-51
    5.1.4 内质网应激在PRRSV感染中的作用  51
    5.1.5 PRRSV诱导的内质网应激与天然免疫反应的关系  51-52
  5.2 结论  52-53
参考文献  53-59
致谢  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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