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细胞骨架介导的RhoA活性在宫颈癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及其机制研究

作　者: 王维莉
导　师: 王萍
学　校: 宁波大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RhoA/ROCK蛋白细胞周期周期蛋白细胞骨架细胞凋亡宫颈癌
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景意义微丝（microfilaments，MFs）和微管（microtubules，MTs）是细胞骨架的两个主要系统，他们在细胞内形成支持网络，进而维持细胞形态。传统观点认为，MTs系统在细胞分裂和胞内运输过程中起关键作用，而MFs对细胞迁移和贴壁等功能至关重要。最近研究发现，MFs还可以调控细胞凋亡、衰老和基因表达，从而赋予了MFs的细胞生长调控功能。细胞骨架结合蛋白之一的RhoA蛋白，是细胞内重要的信号转导分子之一，具有GTP酶活性。文献报道，RhoA主要通过调控MFs的重组参与细胞增殖、迁移和凋亡等过程。抗癌药物紫杉醇（taxol）能够抑制肿瘤细胞增殖的机制在于诱导微管纤维重排成束环绕细胞核周围，阻滞细胞通过G2/M期。然而在此过程中，RhoA活性与细胞骨架的关系，及其在细胞增殖和凋亡过程中的作用尚需无文献报道。本文首先研究RhoA活性及其信号通路对细胞周期的影响及其作用；其次探讨细胞骨架微管纤维排列对细胞周期、凋亡、细胞内RhoA活性的影响；第三阐明细胞骨架微丝纤维排列对细胞周期、凋亡及细胞内RhoA活性的影响；最后，构建RhoA活性定点突变质粒，研究细胞内RhoA活性与细胞骨架、细胞周期和凋亡的相互关系。研究方法（1）MTT实验确定taxol处理宫颈鳞癌细胞的最佳浓度和时间；（2）流式细胞术检测细胞周期变化和RhoA蛋白表达；（3）Western bloting技术检测ROCKI、cyclins、CDKs和劈开的PARP蛋白表达；（4）GST-pulldown方法分析转染质粒后RhoA蛋白活性；（5）激光共聚焦显微镜检测细胞骨架纤维排列和细胞核的变化；（6）构建RhoAT19N突变重组质粒，转染细胞后检测RhoA活性降低后对细胞骨架和细胞周期的而影响。研究结果（1）Taxol诱导C33A细胞内G2/M细胞数和RhoA/ROCKI蛋白表达显著性增加，呈时间依赖性；同时CDK1、cyclinB1、A和D1蛋白表达显著性降低。然而，上述现象被RhoA抑制剂C3转移酶全部逆转；却被ROCKI蛋白抑制剂Y-27632部分逆转，虽与对照相比仍有显著性差异。此外，taxol或RhoA/ROCKI抑制剂对CDK2的表达无显著性影响；（2）Taxol处理诱导CasKi细胞微管纤维聚合成束包绕细胞核；微丝由膜下的环状结构发生重新排列，在细胞质中的聚集明显增加；染色质固缩和细胞核片断化现象和劈开的PARP显著性增加。细胞直径在36h达到峰值后随时间的延长而逐渐缩小。（3）Taxol和微管破坏剂联合处理引起了聚合成束并包绕细胞核的微管解聚、G2/M阻滞现象被抑制、RhoA蛋白的表达和凋亡率显著性降低；而对微丝排列、细胞直径没有影响；（4）Taxol和微丝破坏剂联合处理引起了微丝纤维解聚、细胞直径变小、染色质固缩、核片断化和劈开的PARP蛋白显著性增加、RhoA蛋白的表达显著性降低；然而对微管纤维和G2/M阻滞现象无明显的影响；（5）降低细胞内RhoA活性和taxol联合处理，G2/M细胞数部分降低、细胞直径变小、染色质固缩、核片断化和劈开的PARP蛋白显著性增加；而微丝和微管纤维排列没有发生明显改变。结论（1）Taxol引起的RhoA活性升高抑制了cyclin B1、A、D1和CDK1蛋白表达，进而引起G2/M期阻滞；而下游通路中ROCKI活性仅仅起到部分作用；（2）微管纤维聚合引起的细胞内RhoA活性增强在G2/M期阻滞中扮演重要角色；（3）微丝纤维排列的重新分布虽然在G2/M期阻滞中不起重要作用，但是微丝解聚后能引起的细胞内RhoA活性降低和细胞凋亡率的显著性增加。意义通过研究细胞内RhoA活性、细胞骨架纤维排列、细胞周期和凋亡四者之间的关系，阐明细胞内RhoA活性抗肿瘤细胞凋亡的分子机制。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-12
引言  12-14
1 RhoA/ROCK 信号通路在紫杉醇诱导宫颈癌细胞周期阻滞中的作用  14-26
  1.1 材料和方法  14
    1.1.1 细胞  14
    1.1.2 耗材  14
  1.2 实验仪器  14-15
  1.3 主要试剂及配置  15-18
    1.3.1 主要试剂  15-16
    1.3.2 配制溶液  16-18
  1.4 实验方法  18-19
    1.4.1 C33A 细胞培养和传代  18
    1.4.2 细胞冻存  18
    1.4.3 细胞复苏  18
    1.4.4 MTT 实验  18
    1.4.5 流式细胞术检测细胞周期  18-19
    1.4.6 流式细胞仪检测 RhoA 蛋白表达  19
    1.4.7 Western bloting 检测 ROCKI、cyclins 和 CDKs 的表达  19
    1.4.8 统计学分析  19
  1.5 结果  19-23
    1.5.1 Taxol 对 C33A 细胞生长的影响  19-20
    1.5.2 Taxol 对 C33A 细胞周期的影响  20-21
    1.5.3 Taxol 对 C33A 细胞中 RhoA/ROCKI 蛋白表达的影响  21
    1.5.4 抑制 RhoA 信号通路对 taxol 诱导的 C33A 细胞 G2/M 期阻滞的影响  21-22
    1.5.5 抑制 RhoA 信号通路对 taxol 诱导的 C33A 细胞周期蛋白表达的影响  22-23
  1.6 讨论  23-25
  1.7 结论  25-26
2 RhoA、细胞骨架和细胞周期在紫杉醇抑制宫颈癌发展中的关系及其机制  26-44
  2.1 材料和方法  26
    2.1.1 细胞  26
    2.1.2 耗材  26
  2.2 实验仪器和设备  26
  2.3 主要试剂及药品配制  26-27
    2.3.1 主要试剂  26-27
    2.3.2 药品配制  27
  2.4 实验方法  27-31
    2.4.1 细胞培养、冻存与复苏  27
    2.4.2 MTT 实验  27-28
    2.4.3 流式细胞术检测细胞周期和 RhoA 蛋白表达  28
    2.4.4 免疫荧光染色观察 MFMT 纤维排列方式  28
    2.4.5 RhoAT19N 突变质粒构建  28-30
    2.4.6 将重组载体导入到宿主细胞与筛选  30
    2.4.7 质粒 DNA 的提取  30
    2.4.8 PCI neo/RhoA 突变重组质粒构建  30-31
    2.4.9 含 RhoA 突变 N19RhoA 基因的质粒转染细胞  31
  2.5 Western bloting 检测蛋白表达实验  31-32
  2.6 统计方法  32
  2.7 结果  32-41
    2.7.1 点突变构建携带 RhoA 突变体 RhoAT19N 的重组质粒  32-33
    2.7.2 Taxol 对细胞活力、细胞周期和 RhoA 蛋白表达的影响  33-34
    2.7.3 Taxol 对 MF、MT 纤维排列和细胞凋亡的影响  34-35
    2.7.4 MT 解聚剂对 CasKi 细胞中细胞骨架纤维排列、细胞周期、凋亡和 RhoA蛋白的影响  35-37
    2.7.5 MF 解聚剂对 CasKi 细胞中细胞骨架纤维排列、细胞周期、凋亡和 RhoA蛋白的影响  37-39
    2.7.6 RhoA 活性对 CasKi 细胞中细胞骨架纤维排列、G2/M 期阻滞和凋亡的影响  39-41
  2.8 讨论  41-43
  2.9 结论  43-44
3 全文总结  44-46
参考文献  46-51
附录A 缩略词  51-52
附录B 综述  52-63
  参考文献  58-63
在学研究成果  63-64
致谢  64

细胞骨架介导的RhoA活性在宫颈癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及其机制研究

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