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冬虫夏草多糖的提取及生物活性研究

作　者: 郎久义
导　师: 江国托
学　校: 大连工业大学
专　业: 食品科学
关键词: 冬虫夏草深层培养多糖纯化免疫
分类号: R284.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

冬虫夏草是一种珍贵的药用真菌，具有许多疗效。但是天然冬虫夏草十分稀少，因此采用深层发酵法大规模生产冬虫夏草菌丝体并提取一些有效成分具有十分重要的意义。本论文对冬虫夏草深层发酵技术、冬虫夏草多糖提取及生物活性进行了初步的研究。通过筛选得到冬虫夏草菌株的固体培养条件，以菌丝体湿重和胞外多糖得率为指标，选择出冬虫夏草菌发酵的最适种子培养基、发酵培养基和最佳培养条件。冬虫夏草菌最佳液体种子培养基为：3%葡萄糖，1%蛋白胨，0.4%KH2PO4，0.2%MgSO4；冬虫夏草发酵的最优培养基为：3%葡萄糖，2%豆粕，0.4%KH2PO4，1.0%酵母膏；最优培养条件为：10%接种量，摇床转速140r/min，24℃，pH7.0。经优化培养后冬虫夏草菌的菌丝体湿重和多糖得率比优化前明显提高，分别为102g/L和7.45g/L。为提高冬虫夏草菌有效成分多糖的得率，对冬虫夏草菌胞内、胞外多糖的提取、分离、纯化条件进行了优化选择。研究结果表明，乙醇沉淀胞外多糖优化条件为：沉淀温度-15℃，沉淀时间24h，沉淀pH7.0；热水浸提胞内多糖的优化条件为：浸提温度85℃，浸提时间2h，浸提加水比50:1，浸提pH7.0，浸提两次，Sevag法脱去蛋白。免疫实验表明冬虫夏草多糖能提高动物的免疫力，小鼠灌胃不同剂量的多糖其免疫效果不同。在剂量（200mg/㎏·d）时胞内不去蛋白的多糖对小鼠的肝脏、脾脏、增殖百分率、吞噬指数、IL-2、IFN-γ都有显著提高，与对照组比较分别增为1.22倍、1.32倍、1.78倍、1.27倍、1.29倍、1.27倍。经SephadexG-100分离粗多糖后，用三个吸收峰收集液灌胃小鼠，做免疫实验与对照组比较无显著差异，结果表明冬虫夏草胞内粗多糖不去蛋白对小鼠的免疫促进作用最好。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 冬虫夏草的概述  10-14
    1.1.1 虫草属真菌的研究历史  10-11
    1.1.2 虫草属真菌的种类资源  11
    1.1.3 真菌多糖  11-12
    1.1.4 冬虫夏草的生物学特性  12-14
      1.1.4.1 感染  12
      1.1.4.2 生长  12-13
      1.1.4.3 形态  13
      1.1.4.4 分布  13-14
  1.2 冬虫夏草深层培养概况  14-15
    1.2.1 虫草深层培养的意义  14
    1.2.2 深层培养研究及开发现状  14-15
  1.3 冬虫夏草及其多糖的药理学研究  15-16
    1.3.1 虫草多糖组分的研究  15-16
    1.3.2 多糖的免疫药理作用  16
  1.4 虫草多糖对免疫系统的增强作用  16-19
    1.4.1 对单核巨嗜细胞系统的增强作用  16-17
    1.4.2 虫草多糖的抗肿瘤作用  17-18
    1.4.3 虫草多糖的延缓衰老作用  18
    1.4.4 虫草多糖的降血糖作用  18-19
  1.5 虫草在家禽中的应用  19
  1.6 本论文的研究内容  19-21
第二章材料与方法  21-35
  2.1 实验材料  21-24
    2.1.1 菌株来源  21
    2.1.2 实验动物  21
    2.1.3 主要试剂与药品  21-23
      2.1.3.1 脾脏淋巴细胞转化试验所用溶液配制  22-23
    2.1.4 主要仪器设备  23-24
    2.1.5 培养基  24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 冬虫夏草母种培养条件的选择  24-25
      2.2.1.1 斜面培养基的制备  24
      2.2.1.2 菌株的纯化  24
      2.2.1.3 母种的复壮与扩大培养  24-25
      2.2.1.4 最适培养温度的选择  25
      2.2.1.5 最适 pH 的选择  25
      2.2.1.6 最适碳源的选择  25
      2.2.1.7 最适氮源的选择  25
    2.2.2 冬虫夏草液体培养基的制备  25
    2.2.3 冬虫夏草深层发酵的培养方法  25-26
    2.2.4 发酵液中多糖的测定  26-27
      2.2.4.1 苯酚-硫酸法测定总糖  26-27
      2.2.4.2 胞外多糖的测定  27
      2.2.4.3 胞内多糖的测定  27
    2.2.5 菌丝得率的测定  27
    2.2.6 冬虫夏草液体培养基及培养条件的选择  27-28
      2.2.6.1 最适碳源的选择  27
      2.2.6.2 最适氮源的选择  27-28
      2.2.6.3 最适无机盐的选择  28
    2.2.7 冬虫夏草菌体发酵工艺条件的优化  28-29
      2.2.7.1 最适 pH 值选择  28
      2.2.7.2 接种量比较  28
      2.2.7.3 摇床转速比较  28
      2.2.7.4 培养温度选择  28-29
      2.2.7.5 发酵时间选择  29
    2.2.8 冬虫夏草胞内外粗多糖分离基本方法  29-30
      2.2.8.1 胞外粗多糖分离优化条件的选择试验方案  29
      2.2.8.2 胞内多糖浸提条件的选择试验方案  29-30
    2.2.9 虫草胞内多糖热水抽提工艺条件的确定  30
    2.2.10 新鲜菌丝体(湿菌体)中多糖的提取  30
  2.3 杂蛋白的去除  30-31
  2.4 动物试验  31-33
    2.4.1 试验动物分组  31-32
    2.4.2 实验方法  32-33
      2.4.2.1 碳粒廓清法  32
      2.4.2.2 免疫器官重量的测定：  32
      2.4.2.3 脾脏淋巴细胞转化试验  32-33
      2.4.2.4 小鼠γ干扰素测定  33
      2.4.2.5 小鼠白细胞间介素 2 测定  33
  2.5 柱层析法分离多糖  33-34
  2.6 动物实验  34-35
第三章结果与讨论  35-59
  3.1 冬虫夏草母种培养条件  35-39
    3.1.1 纯化对冬虫夏草菌种的影响  35
    3.1.2 复壮与扩大培养后的冬虫夏草菌株  35
    3.1.3 温度对菌丝生长的影响  35-36
    3.1.4 pH 对菌丝生长的影响  36-37
    3.1.5 碳源对菌丝生长的影响  37-38
    3.1.6 氮源对菌丝生长的影响  38-39
  3.2 冬虫夏草培养基筛选及培养条件优化  39-47
    3.2.1 冬虫夏草培养基的碳源筛选  39-40
    3.2.2 冬虫夏草培养基氮源筛选  40-41
    3.2.3 无机盐对冬虫夏草菌体生长的影响  41-42
    3.2.4 发酵培养基组成的正交试验  42-44
    3.2.5 起始 pH 值对冬虫夏草发酵的影响  44
    3.2.6 接种量对冬虫夏草发酵的影响  44-45
    3.2.7 摇床转速对冬虫夏草发酵的影响  45-46
    3.2.8 培养温度对冬虫夏草发酵的影响  46
    3.2.9 发酵时间对冬虫夏草发酵的影响  46-47
  3.3 沉淀条件的优化  47-49
    3.3.1 沉淀温度的选择  47-48
    3.3.2 浓缩比的选择  48
    3.3.3 沉淀时间的选择  48-49
    3.3.4 沉淀 pH 的选择  49
  3.4 胞内多糖的浸提条件优化  49-52
    3.4.1 浸提加水比的选择  49-50
    3.4.2 浸提时间的选择  50-51
    3.4.3 浸提温度的选择  51
    3.4.4 浸提次数的选择  51-52
    3.4.5 浸提 pH 值的选择  52
  3.5 新鲜菌丝体中多糖的提取率  52-54
  3.6 动物免疫实验  54-56
    3.6.1 冬虫夏草多糖对小鼠免疫器官重量指数的影响  54-55
    3.6.2 冬虫夏草多糖对细胞增殖和吞噬指数的影响  55-56
    3.6.3 冬虫夏草多糖对血清 IL-2、IFN-γ的影响  56
  3.7 冬虫夏草多糖的葡聚糖凝胶柱层析分离结果  56-57
  3.8 动物免疫实验  57-59
第四章结论  59-60
参考文献  60-63
致谢  63

冬虫夏草多糖的提取及生物活性研究

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