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固始鸡胚期消化管发育的研究

作　者: 童川
导　师: 刘忠虎
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 固始鸡鸡胚消化管 HE染色免疫组织化学内分泌细胞半定量PCR
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

固始鸡是我国著名的地方品种鸡,具有外观独特,耐粗饲,肉质细嫩等优点。本实验选用固始鸡鸡胚,通过组织学、免疫组织化学、分子生物学等技术对其消化道的发育进行研究,旨在系统的研究鸡胚消化管发育的组织学特征,并为固始鸡消化生理及相关研究奠定理论基础。组织学结果显示:鸡胚消化管的形成最早开始于胚体前部和后部内胚层的内褶,分别形成开口的前肠门和后肠门,然后头尾两侧的肠管同时向中间延伸,最后在孵育第5天时在卵黄蒂处闭合。第4-6天消化管各段组织学结构基本相似,这个时期可将消化管分为食管、胃、脐前小肠、脐后小肠和大肠五个部分:第4天消化管管壁外侧是脏壁中胚层分化而来的很厚的尚未特异性分化的间充质,内侧(管腔侧)是黏膜上皮,且到第5天结束时脐前小肠有一部分间充质细胞已经开始环形定向分化,形成平滑肌前体细胞,细胞核呈长椭圆形。孵育第5天盲肠开始形成。第6天已经可以将消化管分为:食管、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠。第7-8天几乎所有消化管管壁间充质细胞都已开始特异性的定向分化,出现了纵向分化的平滑肌细胞。可见大量处于分裂期的黏膜上皮细胞,堆积形成很厚的粘膜层,此时固有膜和黏膜肌层尚未凸起进入黏膜上皮形成皱襞或者绒毛,外膜中形成了很多血管。下面按消化管前后顺序对鸡胚发育过程中消化管各段的主要特征进行描述。第13-14天时,食管靠近黏膜上皮的固有层中开始形成明显的黏液腺,黏膜上皮细胞核为圆形。食管在第16天时开始出现复层扁平上皮,细胞核扁平。之后黏液腺逐渐增多,到出壳1天已经形成了很厚的复层扁平上皮及大量的食管腺。胃在第6-7天时,开始分化为腺胃和肌胃,腺胃开始形成大的腺腔。而在第6天之前肌胃和腺胃结构相似,都是由黏膜层和外层包围的间充质构成。随后腺胃腺腔逐渐增多,到出壳第1天时腺胃胃壁由于发达的胃腺已经呈现明显的网状。第6-13天肌胃肌层开始逐渐变的发达,肌胃在第13天时肌层被结缔组织分隔成网状或者束状,并开始形成明显的肌胃腺。小肠和大肠组织学发育基本特征相似,只是在发育过程中小肠的肠道绒毛高度增加相对大肠显著,且由十二指肠到直肠,绒毛逐渐变得扁平。PAS染色显示,第15天盲肠段首先开始出现PAS阳性细胞,之后开始出现在消化管其它部位,主要分布在黏膜上皮和腺上皮。整个鸡胚发育的过程中,消化管细胞细胞核由不易着色,逐渐变为易于着色,细胞由大而圆逐渐变得扁平或者柱状、长梭形等形状,特异性分化为消化管不同部位的细胞。免疫组化结果显示:五羟色胺、胃泌素、生长抑素免疫阳性细胞主要分布在黏膜层,阳性细胞呈圆形,椭圆形、梨形等形状;Ghrelin大片的分布在固有层和环肌层中或者腺胃腺上皮细胞;γ-氨基丁酸呈束状分布在环肌从中。五羟色胺除了在食管和肌胃没有分布以外,其它各段均有分布,第13天最早出现在十二指肠和空肠部位,第17天的时候达到一个阶段性的峰值,且十二指肠分布密度大于其它肠管各段。胃泌素阳性分布只在十二指肠、空肠、回肠段,其它各段均未有分布,十二指肠分布密度大于空肠和回肠。生长抑素最早出现在鸡胚12天腺胃,第15天十二指肠开始出现阳性细胞分布,直肠只在19天时有极少的分布,食管、肌胃、盲肠没有分布。Ghrelin在鸡胚发育第4天的内胚层相关组织有广泛的分布,一直到孵化末期开始逐渐特异性的分布在某些特定的部位和细胞,主要分布在消化管固有层和环肌层,在食管、腺胃和直肠部的阳性面积比例大于消化管其它各段。γ-氨基丁酸在第18天最早出现于十二指肠的肌间神经丛,成束状分布。半定量PCR结果显示:Ghrelin主要表达在腺胃、十二指肠和直肠。在第4天整胚即开始有少量表达,且腺胃表达明显高于其它部位的表达。整个胚期消化管都未检测到生长激素的表达,说明鸡胚消化管的发育不直接依赖于垂体分泌的生长激素。以上结果都表明,固始鸡胚期消化管发育特点与其它相关研究结果相似,但也有其独特的发育规律,这些都为以后相关的研究奠定了一定的理论基础。

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致谢 4-8摘要 8-101 综述 10-23 1.1 固始鸡概述 10-11 1.1.1 固始鸡产地及分布 10 1.1.2 固始鸡的形态及特征 10 1.1.3 固始鸡的研究概述 10-11 1.2 鸡消化管概述 11-15 1.2.1 鸡消化管形态及其结构 11-12 1.2.2 鸡胚消化管研究概述 12-13 1.2.3 消化管内分泌细胞和相关激素的研究 13-15 1.3 五羟色胺、胃泌素、生长抑素及γ-氨基丁酸的研究概述 15-18 1.3.1 五羟色胺、胃泌素、生长抑素及γ-氨基丁酸的结构、分布及生物学功能 15-18 1.3.1.1 五羟色胺的结构、分布和功能 16 1.3.1.2 胃泌素的结构、分布和功能 16 1.3.1.3 生长抑素的结构、分布和功能 16-17 1.3.1.4 γ-氨基丁酸的结构、分布和功能 17-18 1.3.2 五羟色胺、胃泌素、生长抑素及γ-氨基丁酸在鸡胚发育中的研究概述 18 1.4 Ghrelin 及生长激素的研究概述 18-23 1.4.1 Ghrelin 的研究概述 18-20 1.4.1.1 Ghrelin 的结构 18-19 1.4.1.2 Ghrelin 的分布及生物学功能 19-20 1.4.1.3 鸟类Ghrelin 的研究概述 20 1.4.2 生长激素的研究概述 20-23 1.4.2.1 生长激素的结构、分布及生物学功能 20-21 1.4.2.2 生长激素在鸡胚发育中的作用 21-232 引言 23-243 材料与方法 24-32 3.1 试验材料 24-27 3.1.1 试验动物 24 3.1.2 试验仪器 24-25 3.1.2.1 主要组织学试验仪器 24 3.1.2.2 主要分子生物学试验仪器 24-25 3.1.3 试验用试剂 25 3.1.3.1 主要组织学试验用试剂 25 3.1.3.2 主要分子生物学试验用试剂 25 3.1.4 溶液的配置方法 25-27 3.1.4.1 组织学试验用溶液的配置方法 25-27 3.2 试验方法 27-32 3.2.1 组织学实验方法 27-29 3.2.1.1 切片的制备 27-28 3.2.1.2 HE 染色步骤 28 3.2.1.3 PAS 染色步骤 28 3.2.1.4 免疫组化染色步骤 28-29 3.2.2 分子生物学实验方法 29-32 3.2.2.1 引物的设计与合成 29 3.2.2.2 取材及总RNA 的提取 29-30 3.2.2.3 第一链cDNA 的合成 30 3.2.2.4 PCR 扩增 30-31 3.2.2.5 PCR 产物纯化与检测 31-324 结果与分析 32-42 4.1 消化管组织形态学的发生 32-36 4.1.1 食管 33 4.1.2 胃 33-34 4.1.3 小肠 34-36 4.1.4 大肠 36 4.2 鸡胚消化管内分泌细胞的时空分布 36-38 4.2.1 五羟色胺阳性细胞时空分布 36 4.2.2 胃泌素养性细胞时空分布 36-37 4.2.3 生长抑素阳性细胞时空分布 37 4.2.4 Ghrelin 阳性细胞时空分布 37-38 4.2.5 γ-氨基丁酸阳性细胞时空分布 38 4.3 鸡胚GAPDH、Ghrelin 和生长激素mRNA 的表达 38-42 4.3.1 测序结果分析 38 4.3.2 总RNA 的提取 38-39 4.3.3 GAPDH mRNA 的表达 39-40 4.3.3.1 GAPDH 最佳退火温度的确定 39-40 4.3.3.2 GAPDH 半定量结果 40 4.3.4 鸡胚 Ghrelin mRNA 的表达 40-42 4.3.4.1 Ghrelin 扩增的最佳退火温度确定 40-41 4.3.4.2 Ghrelin 半定量结果 41-42 4.3.5 鸡胚生长激素 mRNA 的表达 42 4.3.5.1 生长激素片段扩增的最佳退火温度确定 42 4.3.5.2 生长激素半定量结果 425 结论与讨论 42-45 5.1 固始鸡消化管组织形态学发育 42 5.2 鸡胚消化管内分泌细胞的时空变化 42-44 5.3 生长激素在早期鸡胚发育过程中的作用 44-45参考文献 45-52英文缩略词 52-53图版 53-64Abstract 64-66

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