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棉花GhMDH基因的克隆及其功能分析

作　者: 李青
导　师: 张宁
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 植物学
关键词: 棉花 苹果酸脱氢酶基因 表达载体 原核表达 真核表达 转基因烟草 基因表达分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)广泛存在于各种生物体内，参与生物体的糖代谢、脂代谢等多种代谢途径。其主要功能是催化苹果酸与草酰乙酸的可逆转化。除此之外苹果酸脱氢酶还与植物的抗逆胁迫相关。本研究利用3’,5’-RACE技术，从棉花叶片中克隆出苹果酸脱氢酶基因，命名为GhMDH。把GhMDH基因分别插入到pET-23b和pBin438上，构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH和真核表达载体pBin438-GhMDH。将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)中进行酶蛋白的诱导和表达；将pBin438-GhMDH导入农杆菌(Agrobacterium tumefacious)菌株LBA4404中，通过农杆菌介导法获得转基因烟草植株，并进行了耐铝性分析。获得的主要研究结果如下：1.根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物，利用3’,5’-RACE技术，以“中棉所35”的RNA进行目的片段5’和3’末端的扩增。将5’-RACE和3’-RACE产物电泳检测、回收并连接到pGEM-T载体上，获得重组质粒pGEM-T-GhMDH，转化大肠杆菌感受态DH5α细胞获得阳性克隆进行序列测定，将测序结果用DNAMAN进行拼接，结果表明GhMDH基因全长1130bp，开放阅读框1014bp，编码338个氨基酸，预测的蛋白分子量为35.495KDa，等电点pI=8.94。2.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和原核表达载体pET-23b，回收目的基因以及载体片段，定向连接构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH。通过热激法将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG进行蛋白诱导，诱导出大小约为35KDa的MDH蛋白，并通过测该酶在反应体系L-苹果酸与NAD反应下生成NADH量进而测NADH在340nm处吸光值的变化来对该蛋白进行酶活性测定，经计算GhMDH的活性为2.58U，比活力为129U/mg。3.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和真核表达载体pBin438，回收目的基因以及载体片段进行连接构建了植物表达载体pBin438-GhMDH。采用电激法转化烟草，获得9株转化植株，对经PCR和RT-PCR检测呈阳性的8株转基因植株进行耐铝性测定，结果表明转基因植株对铝毒的耐受性明显高于对照植株。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
缩略词表  8-10
第一章 文献综述  10-22
  1.1 我国棉花生产概述  10-11
    1.1.1 棉花生产的重要性  10
    1.1.2 我国棉花生产现状  10-11
  1.2 苹果酸脱氢酶简介  11-18
    1.2.1 苹果酸脱氢酶的性质  11-12
    1.2.2 苹果酸脱氢酶的结构及功能  12-13
    1.2.3 苹果酸脱氢酶参与的代谢途径  13-17
    1.2.4 苹果酸脱氢酶的用途  17-18
  1.3 重金属离子对植物的危害  18-19
    1.3.1 土壤中重金属离子的污染现状  18
    1.3.2 土壤中的铝离子  18-19
    1.3.3 植物对金属离子的胁迫适应机制  19
  1.4 MDH 基因国内外研究现状  19-20
  1.5 本研究的目的和意义  20-22
第二章 棉花 GhMDH 基因克隆及其序列分析  22-42
  2.1 前言  22
  2.2 实验材料  22-26
    2.2.1 植物材料  22
    2.2.2 菌株和质粒  22
    2.2.3 酶与试剂  22
    2.2.4 溶液配方及常用抗生素与激素的配置  22-24
    2.2.5 模板与引物  24-25
    2.2.6 培养基  25
    2.2.7 仪器与设备  25-26
  2.3 实验方法  26-35
    2.3.1 GhMDH 基因的克隆  26-35
    2.3.2 序列分析  35
  2.4 结果与分析  35-41
    2.4.1 总 RNA 的提取和棉花 GhMDH 基因 EST 目的片段的扩增  35-36
    2.4.2 棉花 GhMDH 基因克隆  36-38
    2.4.3 棉花 GhMDH 基因氨基酸序列分析  38-41
  2.5 讨论  41-42
第三章 原核表达载体构建及蛋白质表达  42-57
  3.1 前言  42
  3.2 实验材料  42-46
    3.2.1 菌株与载体  42
    3.2.2 酶与试剂  42
    3.2.3 溶液配方及常用抗生素与激素的配置  42-45
    3.2.4 模板与引物  45-46
    3.2.5 培养基  46
    3.2.6 仪器与设备  46
  3.3 实验方法  46-51
    3.3.1 带有酶切位点的 GhMDH 基因（简称原核 GhMDH）扩增  46
    3.3.2 原核 GhMDH 基因克隆到 pGEM-Teasy 上及序列检测  46-47
    3.3.3 pGEM-T-原核 GhMDH 质粒提取  47
    3.3.4 pGEM-T-原核 GhMDH 双酶切及酶切产物回收  47
    3.3.5 pET-23b 载体双酶切及酶切产物回收  47-48
    3.3.6 目的基因和表达载体的连接  48
    3.3.7 转化感受态大肠杆菌  48-49
    3.3.8 原核表达载体 pET-23b- GhMDH 的酶切鉴定  49
    3.3.9 工程菌的制备  49
    3.3.10 GhMDH 酶蛋白诱导  49-50
    3.3.11 GhMDH 酶蛋白分离纯化及包涵体复性  50
    3.3.12 重组蛋白酶活性测定  50-51
  3.4 结果与分析  51-55
    3.4.1 重组质粒 pGEM-T-原核 GhMDH 的构建与分析  51
    3.4.2 原核表达载体 pET-23b- GhMDH 的构建与分析  51-52
    3.4.3 工程菌的制备及 PCR 鉴定  52-53
    3.4.4 重组蛋白的诱导与纯化  53-54
    3.4.5 GhMDH 酶活性分析  54-55
  3.5 讨论  55-57
第四章 真核表达载体构建及烟草遗传转化  57-75
  4.1 前言  57
  4.2 实验材料  57-60
    4.2.1 菌株与载体  57
    4.2.2 酶与试剂  57
    4.2.3 溶液配方及常用抗生素与激素的配置  57-58
    4.2.4 模板与引物  58
    4.2.5 培养基  58-60
    4.2.6 仪器与设备  60
  4.3 实验方法  60-67
    4.3.1 带有酶切位点的 GhMDH 基因（简称真核 GhMDH）扩增  60-61
    4.3.2 真核 GhMDH 基因克隆到 PGEM-Teasy 上及序列检测  61
    4.3.3 pGEM-T-真核 GhMDH 质粒提取  61
    4.3.4 pGEM-T-真核 GhMDH 双酶切及酶切产物回收  61
    4.3.5 pBin438 载体双酶切及酶切产物回收  61
    4.3.6 目的基因和表达载体的连接  61-62
    4.3.7 转化感受态大肠杆菌  62
    4.3.8 真核表达载体 pBin438- GhMDH 的酶切鉴定  62
    4.3.9 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备  62-63
    4.3.10 农杆菌的电击转化  63
    4.3.11 烟草无菌苗的培养  63-64
    4.3.12 烟草转化  64-65
    4.3.13 转基因烟草植株筛选  65-66
    4.3.14 转基因烟草植株耐铝性测定  66-67
  4.4 结果与分析  67-72
    4.4.1 重组质粒 pGEM-T-真核 GhMDH 的构建与分析  67
    4.4.2 真核表达载体 pBin438- GhMDH 的构建与分析  67-68
    4.4.3 工程菌的制备及 PCR 鉴定  68-69
    4.4.4 烟草转化结果  69-70
    4.4.5 影响转化效率相关因素  70
    4.4.6 转基因烟草耐铝性测定  70-72
  4.5 讨论  72-75
第五章 结论与展望  75-76
参考文献  76-83
致谢  83-84
作者简介  84-85
导师简介  85-86
导师简介  86-87

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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