学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

作　者: 王晋
导　师: 刘康
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 14-3-3蛋白 RACE 酵母双杂交蛋白质相互作用
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

棉花作为天然纤维的主要来源,是一种重要的经济作物,在世界经济中发挥着重要的作用。随着纺织工业的发展和社会需求的提高,选育并种植高产优质的棉花新品种尤为重要。功能基因组学研究在鉴定大量棉花发育相关基因的同时,初步探索了纤维发育及其调控的分子机制,但是棉花纤维发育的分子生物学机理还远未被揭示。基因的功能最终都要通过直接或间接细胞的信号或调控代谢途径来实现,蛋白质作为基因的表达产物又是细胞主要功能的执行者,其表达、修饰、相互作用的研究是转录组学所不能替代的。14-3-3蛋白最初被认为是动物脑组织所特有的,但是随着各项研究取得不断进展,大量研究表明该蛋白在真核生物细胞中普遍存在,目前已知的功能有：调控植物激素的合成,细胞分裂,细胞凋亡,转运其他蛋白进行亚细胞定位,调控代谢酶,离子转运与转录因子的组装。本研究所前期研究分析了棉花纤维初始发育阶段李氏无纤维突变体(Li1)和野生型(WT)胚珠和纤维的蛋白质组差异,检测并鉴定了两个差异表达的14-3-3蛋白,在此基础上,本研究采用RACE-PCR方法克隆了这两个14-3-3蛋白编码基因的全长,酵母双杂交筛选14-3-3蛋白相互作用的蛋白质组,初步探索了棉花纤维初始发育过程中14-3-3蛋白可能参与生物学过程。主要研究结果如下：1.从棉花中克隆了2个编码14-3-3蛋白基因的cDNA,分别命名为Gh14-3-3-E1、Gh14-3-3-E2,序列比对发现Gh14-3-3-E1为一个全新的棉花14-3-3蛋白家族基因,Gh14-3-3-E2与Gh14-3-3b只差7个碱基,有可能是基因突变造成的。这2个Gh14-3-3基因的编码蛋白结构高度保守,与其他植物14-3-3蛋白有很高的相似度。2.将新得到的两个14-3-3蛋白基因ORF插入pGBKT7载体,成功构建pGBKT7-E1和pGBKT7-E2重组质粒。自激活检测两个诱饵质粒均无自激活现象,经毒性检测证实pGBKT7-E1有毒性不宜筛选,而pGBKT7-E2表现正常可用于筛选酵母cDNA文库。3.通过CLONTECH公司的SMART技术和LD-PCR技术,以徐州142、徐州142突变体、Li,突变体-3、-1、Odpa的胚珠以及徐州142、Li1突变体的+4、+8dpa纤维为材料,提取RNA逆转录和扩增ds cDNA。通过共转化ds cDNA、线性化pGADT7-Rec质粒构建了一个棉花多品种纤维初始发育阶段酵母cDNA文库,为今后研究棉花纤维初始发育打下了良好的基础。4.通过酵母双杂交系统筛选出6个与Ghl4-3-3-E2相互作用的蛋白片段,功能区主要涉及植物跨膜信号转导以及转录调节等方面。后续的工作可以利用基因克隆技术如RACE对筛选蛋白进行全长克隆,通过定点突变等研究相互作用位点及方式,阐明关键氨基酸的作用。

全文目录

摘要 9-11ABSTRACT 11-13本文主要缩略词 13-15第一部分文献综述 15-33 第一章蛋白质组学概论 15-21 1 蛋白质组学的定义及分类 15 2 蛋白质组学基本研究方法 15-17 2.1 蛋白质分离技术 15-16 2.2 质谱技术 16 2.3 生物信息学与蛋白质组学 16-17 3、植物蛋白质组学及其进展 17-19 3.1 植物遗传分类分析 17 3.2 亚细胞水平植物蛋白质组学研究进展 17-18 3.3 植物发育蛋白质组学进展 18 3.4 植物逆境蛋白质组学 18-19 4、蛋白质相互作用及其研究方法进展 19-21 第二章酵母双杂交概论 21-27 1 酵母双杂交原理 21 2 酵母双杂交的应用 21-22 3 酵母双杂交的优缺点 22-23 4 酵母双杂交的发展及新技术应用 23-27 4.1 酵母双杂交技术改进 23-24 4.2 酵母双杂交系统的衍生系统 24-27 4.2.1 酵母单杂交系统以及酵母三杂交系统 24 4.2.2 反向酵母双杂交系统 24 4.2.3 双诱饵酵母双杂交系统 24 4.2.4 基于膜相互作用的酵母双杂交系统 24-25 4.2.5 其他双杂交系统 25-27 第三章 14-3-3蛋白及其研究进展 27-33 1 14-3-3蛋白概述 27 2 14-3-3蛋白的结构 27-28 3 14-3-3蛋白主要功能 28-30 3.1 14-3-3蛋白与信号转导 28-29 3.2 14-3-3蛋白与植物代谢调节 29-30 3.2.1 14-3-3蛋白调节离子通道 29 3.2.2 14-3-3蛋白调节氮代谢关键酶 29 3.2.3 14-3-3蛋白调节碳代谢关键酶 29-30 3.2.4 14-3-3蛋白与逆境响应 30 4 棉花14-3-3蛋白研究进展 30-33研究意义 33-35第二部分研究报告 35-77 第四章棉花胚珠14-3-3蛋白基因克隆 35-51 1 材料与方法 35-44 1.1 材料 35-37 1.1.1 植物材料 35 1.1.2 菌株、试剂与引物 35-36 1.1.3 常用溶液及培养基 36-37 1.1.4 RNA提取所需试剂配制 37 1.2 方法 37-44 1.2.1 棉花胚珠总RNA的提取及纯化 37-38 1.2.2 14-3-3蛋白的3'RACE 38-41 1.2.2.1 3’RACE的cDNA第一链合成 38 1.2.2.2 内标扩增检测 38-39 1.2.2.3 目标基因的3’RACE 39 1.2.2.4 PCR扩增产物的琼脂糖电泳、回收 39-40 1.2.2.5 回收产物连接转化及测序 40-41 1.2.3 14-3-3蛋白的5'RACE 41-43 1.2.3.1 5'RACE的cDNA第一链合成 41-42 1.2.3.2 5'RACE PCR 42-43 1.2.4 14-3-3蛋白全长序列的克隆 43-44 1.2.5 序列分析 44 2 结果分析 44-50 2.1 棉花胚珠总RNA提取 44-45 2.2 两个14-3-3蛋白基因的RACE 45-50 2.2.1 RACE第一链合成的内标检测 45 2.2.2 14-3-3蛋白基因的RACE 45-46 2.2.3 14-3-3蛋白基因全长的扩增 46-48 2.2.4 14-3-3蛋白的生物信息学分析 48-50 3 讨论 50-51 第五章 14-3-3蛋白诱饵载体构建及毒性检测 51-59 1 材料与方法 51-54 1.1 材料 51-52 1.1.1 菌株、质粒及引物 51 1.1.2 常用药品 51 1.1.3 常用酵母培养基配制 51-52 1.2 方法 52-54 1.2.1 两个14-3-3蛋白编码区加入酶切位点 52 1.2.2 14-3-3蛋白与pGBKT7 DNA-BD Cloning Vector连接 52-53 1.2.3 诱饵质粒转化酵母 53-54 1.2.3.1 酵母感受态制备 53 1.2.3.2 质粒转化酵母感受态细胞 53-54 1.2.4 诱饵自激活检测及毒性检测 54 1.2.4.1 自激活检测 54 1.2.4.2 毒性检测 54 2 结果分析 54-58 2.1 带酶切位点的14-3-3蛋白克隆 54-55 2.2 酶切连接构建14-3-3蛋白诱饵 55 2.3 诱饵毒性及自激活检测 55-58 2.3.1 毒性检测 55-56 2.3.2 自激活检测 56-58 3 讨论 58-59 第六章棉花胚珠cDNA酵母文库构建及评价 59-67 1 材料与方法 59-61 1.1 材料 59 1.1.1 植物材料 59 1.1.2 试剂及试剂盒 59 1.1.3 常用培养基和溶液配方 59 1.2 方法 59-61 1.2.1 总RNA提取 59 1.2.2 cDNA的合成及纯化 59-60 1.2.3 酵母Y187感受态细胞的制备和文库转化 60-61 1.2.3.1 Y187感受态细胞的制备 60 1.2.3.2 文库转化 60-61 1.2.4 转化子的筛选及收集 61 1.2.5 检测插入片段大小 61 2 结果分析 61-65 2.1 总RNA提取 61-62 2.2 ds cDNA合成 62 2.3 转化子的筛选 62-63 2.4 文库检测 63-65 3 讨论 65-67 第七章棉花胚珠cDNA酵母文库的筛选 67-77 1 材料与方法 67-70 1.1 材料 67 1.2 方法 67-70 1.2.1 酵母双杂交文库筛选 67-68 1.2.2 阳性克隆的鉴定及测序 68-70 1.2.2.1 酵母质粒提取 68-69 1.2.2.2 阳性质粒的转化 69 1.2.2.3 阳性克隆插入片段检测 69 1.2.2.4 阳性克隆比对分析 69-70 2 结果分析 70-74 2.1 阳性克隆鉴定及测序 70 2.2 阳性克隆序列分析 70-74 3 讨论 74-77第三部分全文结论 77-79参考文献 79-87附录 87-93致谢 93

棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

内容摘要

全文目录

相似论文