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棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究

作　者: 郝佩佩
导　师: 刘康
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 纤维 Pro-Q Diamond特异性染色法 磷酸蛋白质组学
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


棉纤维是重要的纺织工业原料,在国民经济和人民生活中占有重要的地位。棉花纤维实质上是种皮毛,是从胚珠外表皮细胞分化而来的一种单细胞结构,是迄今为止发现的最长的植物细胞。作为研究细胞伸长的理想模式植物,科学家们一直致力于揭示棉纤维发育的分子机理。棉花分子生物学、功能基因组学的发展已大大促进了棉花纤维发育过程中基因的表达谱及其调控机制的研究。但是,在蛋白质翻译、蛋白质分解、运输和翻译后修饰(如磷酸化、糖基化、酰基化)等水平上的棉花蛋白质组学研究较少。本文着重于对棉花纤维初始发育时期的磷酸蛋白质组学研究,一方面是因为棉花原始纤维细胞的分化决定着种皮细胞是否能发育成为纤维；另一方面是因为可逆的磷酸化修饰是细胞信号转导的重要途径,在生物发育过程中起着关键的调节作用。因此,开展棉花纤维初始发育时期的磷酸蛋白质组学研究对于深入探究棉花纤维分化和突起的分子调控机制有着重要的意义。本文以陆地棉品种徐州142(WT)及其无绒无絮突变体(fl)初始发育时期的开花前3天(-3 DPA)、1天(-1 DPA)、开花当天(0 DPA)的胚珠为材料,通过比较磷酸化蛋白质组学的分析,鉴定了与棉花纤维初始发育相关的磷酸蛋白质,分析了蛋白质磷酸化修饰在棉花初始发育中所起的重要作用,并探讨了棉花纤维分化和突起的可能机理。研究结果如下：1.由于棉花富含酚类和多糖,而磷酸化蛋白质在提取的过程中又十分容易脱磷酸化,因此本研究首先评价了TCA-苯酚法和改良苯酚法两种蛋白提取方法在蛋白产量、蛋白纯度和电泳图谱等方面的差异,明确了改良苯酚法能最大限度的保证磷酸蛋白质的质量和产量,适用于提取棉花胚珠总蛋白应用于磷酸化蛋白质组学研究。同时发现,选用pH 4～7的18cm IPG胶条,以被动吸涨上样方式来进行IEF的双向电泳能很好地分离棉花胚珠磷酸蛋白质。2.采用MOAC(金属氧化物/氢氧化物亲和层析)先富集磷酸化蛋白质再对其进行2-DE分析,和先对总蛋白质进行2-DE分析再用Pro-Q Diamond磷酸化特异性染色染料进行染色这两种策略分析棉花磷酸化蛋白质,对比双向电泳图谱发现,直接对棉花总蛋白2-DE胶进行Pro-Q Diamond特异性染色所得到的磷酸蛋白质图谱蛋白质点较多,能对棉花胚珠中的磷酸蛋白质进行全景式的观察与分析。初步建立了双向电泳—特异性荧光染色—质谱鉴定的棉花磷酸化蛋白质组研究的技术路线。3.在此技术平台基础上,本文对WT和.fl纤维初始发育阶段的-3、-1、0 DPA胚珠的磷酸蛋白质进行了比较分析。经PDQuest软件分析,共检测到73个差异表达磷酸蛋白质,通过MALDI-TOF-TOF MS/MS分析,成功鉴定了63种磷酸蛋白质。这些蛋白质主要涉及氧化-还原动态平衡与调控；蛋白合成、加工、降解；糖代谢和呼吸代谢；细胞骨架等生物学过程。初步揭示了磷酸化作用在棉花纤维初始发育中起重要的调控作用,并为进一步研究其调控机制提供了线索和候选蛋白质。本研究是首次运用磷酸化蛋白质组学研究方法分析棉花纤维分化和起始发育的分子机理。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11本文所用缩略语  11-13第一部分 文献综述  13-31  第一章 棉花纤维初始发育的研究进展  13-17    1 棉纤维原始细胞分化和突起  13-15      1.1 棉纤维原始细胞突起的部位  13-14      1.2 棉纤维原始细胞突起的数量  14      1.3 棉纤维分化起始的超显微结构分析  14-15    2 棉纤维细胞分化起始期相关基因研究  15-16    3 激素对棉纤维分化的影响  16-17  第二章 蛋白质组学与磷酸蛋白质组学研究进展  17-31    1 蛋白质组学研究概述  17-23      1.1 蛋白质组学的研究内容与意义  17-19      1.2 蛋白质组学研究技术  19-23        1.2.1 蛋白质分离技术  19-21        1.2.2 生物质谱技术  21-22        1.2.3 生物信息学  22-23    2 磷酸蛋白质组学研究  23-29      2.1 蛋白质的磷酸化修饰  23-24      2.2 磷酸蛋白质组学研究概况  24      2.3 磷酸蛋白质组学研究技术  24-29        2.3.1 放射性标记  24-25        2.3.2 磷酸化蛋白质的荧光检测  25-26        2.3.3 质谱技术鉴定磷酸化蛋白质  26-27        2.3.4 富集技术  27-29    3 磷酸蛋白质组学在植物中的研究进展及应用  29-31本研究的目的和意义  31-33第二部分 研究报告  33-85  第三章 适用于磷酸蛋白质组学研究的总蛋白质提取及双向电泳方法的研究  33-41    1 材料与方法  33-36      1.1 植物材料  33      1.2 试验方法  33-36        1.2.1 改良苯酚法提取棉花胚珠总蛋白  33-34        1.2.2 TCA+苯酚法提取棉花胚珠总蛋白  34        1.2.3 蛋白质的溶解  34        1.2.4 蛋白质的定量  34-35        1.2.5 IEF  35        1.2.6 SDS-PAGE电泳  35        1.2.7 聚丙烯酰胺胶胶染色  35-36        1.2.8 图像扫描与分析  36    2 结果与分析  36-39      2.1 两种方法提取的蛋白质质量的比较  36      2.2 两种方法提取蛋白质的2-DE胶图谱的比较  36-37      2.3 IPG胶条pH范围的选择  37-38      2.4 IEF不同上样方法对棉花胚珠蛋白质2-DE的影响  38-39    3 讨论与结论  39-41  第四章 棉花磷酸蛋白质组分析方法的研究  41-51    1 材料与方法  41-45      1.1 植物材料  41      1.2 试验方法  41-45        1.2.1 通过富集法分离磷酸化蛋白质  41-44        1.2.2 通过特异性染色法分析磷酸化蛋白质  44-45    2 结果与分析  45-48      2.1 MOAC富集法分析磷酸化蛋白质  45-48        2.1.1 SDS-PAGE电泳检测Al(OH)_3亲和层析法富集的磷酸蛋白质  46        2.1.2 双向电泳检测Al(OH)_3亲和层析法富集的磷酸蛋白质  46-47        2.1.3 Qigaen phoPsohprotein puriification Kit (TiO_2)富集磷酸蛋白质  47-48      2.2 Pro-Q Diamond特异性染色法分析磷酸化蛋白质  48    3 讨论与结论  48-51  第五章 棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究  51-85    1 材料与方法  51-53      1.1 植物材料  51      1.2 试验方法  51-53        1.2.1 棉花胚珠总蛋白提取  51        1.2.2 蛋白质的溶解、定量、双向电泳、染色、图像扫描和分析  51        1.2.3 挖胶和脱色  51-52        1.2.4 酶切  52        1.2.5 质谱分析  52        1.2.6 数据库搜索和生物信息学分析  52-53    2 结果与分析  53-77      2.1 不同初始发育时期的棉花胚珠磷酸蛋白质及总蛋白2-DE胶图谱比较分析  53-58      2.2 差异表达磷酸蛋白质的鉴定  58-77        2.2.1 氧化还原动态平衡和调节相关蛋白质  59-60        2.2.2 蛋白质合成、折叠、修饰相关蛋白  60        2.2.3 糖代谢和呼吸代谢相关蛋白质  60-61        2.2.4 蛋白质降解相关蛋白质  61        2.2.5 细胞骨架相关蛋白质  61-77    3 讨论与结论  77-85      3.1 氧化还原动态平衡和调节  77-80      3.2 蛋白质合成、折叠、修饰相关蛋白  80-81      3.3 糖代谢和呼吸代谢相关蛋白质  81-83      3.4 蛋白质降解相关蛋白质  83      3.5 细胞骨架相关蛋白质  83-84      3.6 其它蛋白质  84-85第三部分 全文结论  85-87参考文献  87-95致谢  95

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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