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STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选

作　者: 张利仙
导　师: 陈朝银；周晓黎
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 猴嗜T淋巴细胞病毒 gag蛋白 杆状病毒表达载体 间接ELASA 单克隆抗体
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


根据已报道的STLV-1病毒gag蛋白基因(Genbank登录号：AY590142),人工合成猴STLV-1病毒gag基因,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切及测序鉴定,成功地构建了猴STLV-1病毒gag基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTB-gag。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DHlOBac感受态细胞,经卡那霉素、庆大霉素和四环素平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒Bacmid-gag。在此基础上,提取Bacmid-gag杆粒,并转染Sf9昆虫细胞,96h后反复冻融细胞,收集上清液,获得杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting分析表明初步获得了表达的gag蛋白大小约为55kD,并且具有良好的免疫学活性。用纯化的gag蛋白作为诊断抗原建立了检测猴STLV-1病毒抗体的间接ELISA方法。Gag抗原最适包被浓度为0.28μg/孔,待检血清最适稀释度为1：100,HRP酶标二抗的最适工作浓度为1：5000,间接ELISA的判定标准为：OD450nm≥0.327时判定为阳性,OD450nm≤0.285时判定为阴性,二者之间为可疑。该检测方法不与猴B病毒、猴D型反转录病毒的阳性血清发生交叉反应。与商品化的ELISA试剂盒检测方法相比,对来自云南省的200份现地猴血清进行检测,检测结果表明ELISA方法的特异性和敏感性都较高,并且两者的符合率达到98.5%,建立的间接ELISA方法为STLV-1病毒抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。研究采用重组表达并纯化的gag蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,经三次免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用本研究第四章实验建立的间接ELISA方法检测、筛选出阳性杂交瘤细胞克隆,并经有限稀释法克隆化培养获得gag蛋白特异性杂交瘤细胞一株：3B6。杂交瘤细胞株的成功筛选为单克隆抗体的制备和进一步建立检测STLV-1抗体的竞争ELISA检测方法奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5ABSTRACT  5-11插图和附表清单  11-12缩略表  12-13第一章 绪论  13-21  1.1 猴嗜T淋巴白血病病毒STLV概况  13-17    1.1.1 STLV病毒学特点  13-14    1.1.2 STLV的类型和生物学特点  14-15    1.1.3 STLV的传播途径和流行概况  15-16    1.1.4 STLV检测技术研究进展  16-17  1.2 昆虫杆状病毒表达系统概况  17-19  1.3 研究目的和意义  19-21第二章 STLV病毒gag基因杆状病毒表达载体的构建  21-35  2.1 引言  21  2.2 材料与方法  21-23    2.2.1 质粒和菌种  21    2.2.2 主要试剂  21-22    2.2.3 主要仪器  22-23  2.3 技术路线  23  2.4 实验方法  23-31    2.4.1 引物  23-24    2.4.2 PCR反应扩增目的基因  24-25    2.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  25-26    2.4.4 克隆载体PMD19-T-gag的构建  26-28    2.4.5 重组表达质粒pFastBacHTB-gag的构建及鉴定  28-29    2.4.6 重组杆粒Bacmid-gag的构建  29-31  2.5 结果与分析  31-33    2.5.1 重组质粒pFastBacHTB-gag的构建  31-32    2.5.2 重组杆粒Bacmid-gag的PCR鉴定  32    2.5.3 杆状病毒表达载体Bacmid-gag的浓度  32-33  2.6 小结  33  2.7 讨论  33-35    2.7.1 载体的构建  33    2.7.2 阳性对照的建立  33-35第三章 Gag蛋白在sf9昆虫细胞中的表达及纯化  35-49  3.1 引言  35  3.2 材料与方法  35-39    3.2.1 主要试剂  35-39    3.2.2 主要仪器  39  3.3 实验方法  39-43    3.3.1 sf9细胞培养  39-40    3.3.2 杆状病毒对sf9昆虫细胞的转染  40    3.3.3 重组蛋白的表达  40-41    3.3.4 重组蛋白的检测及鉴定  41    3.3.5 表达产物的纯化及鉴定  41-43  3.4 结果与分析  43-46    3.4.1 细胞转染结果  43-44    3.4.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析  44-45    3.4.3 重组蛋白的Western blot鉴定  45-46    3.4.4 纯化后蛋白浓度的测定  46  3.5 小结  46  3.6 讨论  46-49    3.6.1 昆虫细胞培养注意事项  46    3.6.2 昆虫细胞转染  46-47    3.6.3 重组蛋白的表达  47-48    3.6.4 重组蛋白的纯化  48-49第四章 STLV-1间接ELISA方法的建立及应用  49-65  4.1 引言  49  4.2 材料  49-50    4.2.1 抗原  49    4.2.2 血清和酶标抗体  49    4.2.3 ELISA相关溶液  49-50    4.2.4 主要仪器  50  4.3 实验方法  50-53    4.3.1 间接ELISA操作步骤  50-51    4.3.2 抗原浓度和血清稀释度的确定  51    4.3.3 最佳封闭液的确定  51    4.3.4 最佳封闭时间的确定  51-52    4.3.5 血清反应时间的确定  52    4.3.6 酶标二抗工作浓度的确定  52    4.3.7 最佳酶标二抗作用时间  52    4.3.8 间接ELISA实验结果判定标准  52    4.3.9 与商品化试剂盒的符合率检测  52    4.3.10 间接ELISA方法的特异性评价  52-53    4.3.11 间接ELISA方法的批内、批间重复性的评价  53  4.4 结果与分析  53-62    4.4.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度  53-54    4.4.2 最佳封闭液的确定  54-55    4.4.3 最佳封闭时间的确定  55-56    4.4.4 一抗最佳作用时间  56-57    4.4.5 酶标二抗最佳工作浓度  57-58    4.4.6 酶标二抗最佳作用时间  58-59    4.4.7 间接ELISA判定标准的确定  59-60    4.4.8 与商品化试剂盒的符合率评价  60    4.4.9 特异性评价  60-61    4.4.10 批间及批内重复性实验检测结果  61-62  4.5 小结  62  4.6 讨论  62-65第五章 杂交瘤细胞的制备  65-75  5.1 引言  65  5.2 材料  65-66    5.2.1 抗原  65    5.2.2 实验动物与细胞  65    5.2.3 主要试剂  65-66    5.2.4 主要仪器  66  5.3 实验方法  66-70    5.3.1 动物免疫  66    5.3.2 骨髓瘤细胞的制备  66    5.3.3 饲养细胞的制备  66-67    5.3.4 脾细胞制备  67    5.3.5 细胞融合  67-68    5.3.6 融合细胞的培养  68    5.3.7 杂交细胞的筛选  68-69    5.3.8 杂交瘤细胞的克隆化培养  69    5.3.9 杂交瘤细胞的扩大培养  69    5.3.10 杂交瘤细胞的冻存  69-70  5.4 结果与分析  70-72    5.4.1 SP2/O细胞培养结果  70    5.4.2 阳性杂交瘤细胞的筛选  70    5.4.3 杂交瘤细胞株克隆化结果  70-72  5.5 小结  72  5.6 讨论  72-75    5.6.1 动物免疫  72-73    5.6.2 细胞的融合  73    5.6.3 杂交瘤细胞的筛选  73-74    5.6.4 杂交瘤细胞克隆化  74-75第六章 总结与展望  75-77  6.1 本研究小结  75  6.2 工作展望  75-77致谢  77-79参考文献  79-87附录A 攻读硕士期间发表论文目录  87-88附录B STLV-1 gag基因序列  88-89附录C PFastBacTM-HTB载体克隆位点图  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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