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RNA干扰沉默GPC3基因诱导肝癌细胞凋亡及其机制的研究

作　者: 刘士源
导　师: 李玉民
学　校: 兰州大学
专　业: 普通外科学
关键词: RNA干扰 肝细胞癌 细胞凋亡 Cytochrome c 分子机制 信号通路
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


背景与目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是严重威胁全世界人民健康和生存的恶性肿瘤之一,因其早期诊断困难,极易复发转移,放化疗效果不佳而被称为“癌中之王”,所以探索及寻找新的HCC标记物多年来一直是HCC研究领域的热点。近年来,随着人类基因组学、蛋白质组学、肿瘤免疫等相关研究技术的飞速发展,HCC肿瘤标志物的研究已取得了长足的进展。研究发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC3)是HCC患者血清及癌组织中过度表达的癌抗原之一,而且可能与肝癌的一对前期病变,慢性肝炎(CH)和肝硬化(LC)的发展有关,初步展示出作为新的HCC蛋白类标志物的临床应用潜能。此外,作为一种癌蛋白,GPC3对HCC细胞的生长与增殖等生物学行为亦具有重要作用,具体机制目前研究尚不明朗。所以深入研究GPC3促进HCC发生发展的分子机制,阐明GPC3在肝癌细胞中促进增殖和凋亡抵抗作用及具体分子机制,为肝癌基因靶向治疗提供理论依据,对探讨GPC3在HCC早期诊断、治疗甚至预后判断中的价值具有重要意义。本项研究首先设计合成针对GPC3基因的StealthTM RNAis,瞬时转染高表达GPC3蛋白的HCC细胞株HepG2,之后建立RNA干扰(RNAi)抑制HepG2细胞GPC3基因表达的实验条件,观察利用RNAi在转录水平靶向性抑制GPC3基因表达对人肝癌细胞株HepG2生长、凋亡的影响及具体分子机制。方法1.用ELISA法及Western blott方法检测GPC3蛋白在肝癌细胞株的表达水平。2.设计合成针对GPC3基因的StealthTM RNAis,使用转染试剂LipofectamineTM RNAi Max transfection Agent瞬时转染高表GPC3蛋白的HCC细胞株HepG2,采用荧光定量PCR方法检测SealthTM RNAi对HePG2细胞GPC3表达的影响,并筛选具有最佳沉默效应的StealthTM RNAi用于之后的基因沉默实验。3.选取具有最佳沉默效应的StealthTM RNAi转染并沉默HepG2细胞株GPC3的表达,用SRB方法观察各组细胞的增殖活性；用TUNEL法检测沉默GPC3后细胞的凋亡情况：流式细胞术检测GPC3基因沉默后HepG2细胞的凋亡率。4Western blott方法检测不同时间点GPC3沉默前后凋亡相关蛋白的表达水平变化,探索GPC3沉默后HCC细胞凋亡的具体分子机制。结果1.肝癌细胞系HepG2、Huh-7高表达GPC3,而SMMC-7721肝癌细胞株低表达GPC3。2.转染GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞GPC3基因表达水平。其中HSS149与三条StealthTM RNAi的Cocktail对GPC3的表达具有更强的抑制作用。与空白组相比,HSS149转染48及72小时后HepG2细胞中GPC3基因表达水平明显下降(95.90%、96.25%)；Cocktail转染后GPC3基因表达水平下降更明显(96.27%、96.36%)。3.GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞的增殖。Cocktail转染24、48及72小时后,HepG2细胞的增殖的抑制率分别为：40.67%,48.34%和57%。4.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显诱导HepG2细胞发生凋亡,TUNEL法可见明显凋亡小体,流式细胞仪检测发现,转染72小时后,HepG2细胞凋亡率明显上升。5.GPC3靶向StealthTM RNAi转染后,HepG2细胞GPC3、Bcl-2、Procaspase-3以及细胞线粒体Cytochrome c蛋白水平明显降低,而Bax及细胞胞浆中Cytochrome c的蛋白水平明显升高。结论1.GPC3在肝癌细胞系HepG2、Huh-7中高表达。2.GPC3靶向StealthTM RNAi可明显抑制HepG2细胞中GPC3基因和蛋白的表达水平。3.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显抑制HepG2细胞的增殖。4.GPC3靶向StealthTM RNAi转染可明显诱导HepG2细胞发生凋亡。5.沉默GPC3基因诱导HepG2发生凋亡可能是通过Bax/Bcl-2/Cytochrome c/Caspase-3信号通路完成。6.GPC3基因表达在HCC的凋亡抵抗以及发生发展中起重要作用,其可作为新颖的HCC基因治疗靶点而需要进一步深入研究。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-10
主要縮略词表  10-11
前言  11-16
  肝癌  11-12
  肝癌肿瘤标记物  12
  GPC3基因与肝癌  12-14
  RNA干扰与肿瘤治疗  14-16
第一章 GPC3蛋白在肝癌细胞株中表达水平的测定  16-34
  1.1 研究背景  16
  1.2 实验材料与方法  16-32
  1.3 实验结果  32-34
第二章 RNAi沉默HepG2细胞GPC3基因的实验研究  34-48
  2.1 研究背景  34-35
  2.2 实验材料与方法  35-44
  2.3 实验结果  44-48
第三章 沉默GPC3基因对肝癌细胞增殖凋亡的影响  48-56
  3.1 研究背景  48
  3.2 实验材料与方法  48-51
  3.3 实验结果  51-56
第四章 沉默GPC3诱导肝癌细胞凋亡的分子机制研究  56-66
  4.1 研究背景  56-59
  4.2 实验材料与方法  59-61
  4.3 实验结果  61-66
第五章 结论与展望  66-71
  5.1 结论  66
  5.2 讨论与展望  66-71
参考文献  71-78
综述  78-88
  参考文献  84-88
在学期间的研究成果  88-89
致谢  89-90

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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