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Rac1基因对大肠癌生物学行为的影响

作　者: 赵世义
导　师: 张振书
学　校: 南方医科大学
专　业: 消化内科
关键词: Rac1 RNAi 结直肠癌结直肠癌细胞细胞骨架侵袭转移细胞凋亡细胞周期
分类号: R735.34
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大肠癌是常见的恶性肿瘤,发病率在我国居恶性肿瘤第四位。虽然经过多年努力,大肠癌的治疗已取得了长足进展,早期癌患者的治愈率得到明显提高。但对于并发转移或出现复发的大肠癌患者,其治疗仍然不乐观。因此,迫切需要寻找新的治疗手段,其中基因治疗是近年来研究的热点方向之一。肿瘤侵袭转移是一个非常复杂的多步骤过程,需要突破细胞外基质和基膜组成的多个结构屏障,然后在远隔部位建立新的增殖旺盛的细胞集落,其中的每个事件都相当复杂,整个过程受到许多条信号转导通路相互交联、组成的信号转导网络的精确调控。此外,肿瘤细胞的侵袭转移,一方面需要胞外蛋白酶降解周围组织外,另方面需要肿瘤细胞本身的迁移能力。众所周知,肿瘤的发生和进展与细胞周期和细胞凋亡调节失控有关。细胞周期分为DNA合成前期（G₁期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G₂期）和有丝分裂期（M期）。研究发现,细胞周期进程的调节、胞外蛋白酶的激活和细胞移动都经过许多相同的信号传导通路。细胞移动需要功能完整的细胞骨架,包括细胞板状伪足的形成、胞体的突起和收缩,这个过程除了在细胞分裂的M期需要微管蛋白参与外,细胞肌动蛋白微丝和微管蛋白的重组也参与其中。在细胞周期进程中,也同样需要一个完整的细胞骨架来越过G₁-S期细胞检查点,才能完成一个细胞周期。Rho蛋白属于Ras超家族小分子量单体结合蛋白（包括Rho、Rac1、Cdc42）,具有GTP酶活性,在肿瘤的发生发展中扮演重要角色,尤其是Rho蛋白及其下游的效应分子,通过多种信号转导通路,参与了肿瘤的恶性转型、浸润转移及血管生成等过程。Rac1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Ras相关的C3肉毒杆菌底物1）则是其重要成员之一,GenBank概述它的作用是控制细胞生长、细胞骨架的重组和蛋白激酶的激活。研究发现,Rac1在细胞迁移、细胞与细胞及细胞与细胞外基质的黏附、细胞分裂和细胞失巢凋亡（anoikis）等方面有重要作用。Rac1蛋白存在失活状态（Rac1-GDP）和激活状态（Rac1-GTP）两种形式,在细胞信号转导通路中作为信号转换器或分子开关,作用于细胞骨架或其靶蛋白而产生生物效应。已知Rac1的上游调节分子之一是Tiam1—即T淋巴瘤侵袭转移诱导因子;其下游效应分子之一是PAK1一即P21激活激酶1,Rac1的不同作用通过调节不同的信号转导通路来实现。研究发现,Rac1与某些肿瘤的侵袭转移和进展有密切相关性,表现在:①Rac1与细胞骨架的关系。Rac1的主要功能是调节肌动蛋白细胞骨架的重建,Rac1对于肌动肌球蛋白收缩的形成,黏着斑的黏附是基本的。某些生长因子,如血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）和胰岛素都能通过激活Rac1来诱导肌动蛋白层形板足的形成和细胞膜皱褶的形成。Rac1在肌动蛋白细胞骨架集合和解离过程起了重要作用,如胞质的分裂,吞噬作用和细胞迁移。另外,钙黏连素和E-选择蛋白介导的细胞与细胞的接触、整合素和细胞外基质的接触、细胞转化,还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶活性、NO的生成、磷脂酶活性以及细胞凋亡和存活都与Rac1功能有关。②Rac1与细胞周期和细胞凋亡的关系。Rac1一方面可以在G₁期调节细胞周期蛋白D1,另一方面可以通过对肌球蛋白轻链的磷酸化修饰,以调节肌动肌球蛋白的形成和收缩而影响肌动蛋白的细胞骨架。由于细胞周期和细胞移动调节的交叉,通过阻滞细胞周期进程可以减缓细胞的移动,这足以说明细胞周期和细胞移动的相关性。鉴于细胞移动和细胞周期进程中细胞动力和细胞骨架的重要作用,可以得出细胞周期的变化和与之相关的细胞移动都是由于调节细胞骨架引起。③Rac1还通过调节信号转导子与转录激活子-3和信号转导子与转录激活子-5而调节细胞的迁移、增殖和上皮向间质细胞的转型,参与了恶性肿瘤的转化与进展。如何调控Rac1蛋白的活性,来达到治疗肿瘤的目的,目前尚不明确,一般认为可通过一下途径:①抑制Rac1蛋白碳末端异戊二烯化,Rac1蛋白碳末端有个CAAX盒子结构,它决定是哪一种异戊二烯残基连在上面。蛋白质异戊二烯化需要合适的细胞内定位和GTPase的功能,包括Rho和Ras。Rac1蛋白能够接受法尼基修饰和香叶香叶基酯化修饰,而Rho和Cdc42 GTPases只能接受香叶香叶基酯化修饰。②抑制GEFs（Guanosine nucleotide exchangefactors,鸟苷酸交换因子）的活性,GEFs可以调节Rac1蛋白的活性,选择GEFs抑制剂最理想的结果是,它只抑制某一个Rac1蛋白而不影响Rac1其他亚型的活性。③抑制Rac1效应蛋白的活性,Rac1蛋白通过与不同的效应物作用启动不同的下游反应,因此,通过药物阻滞Rac1蛋白与某一效应物结合,或抑制某一Rac1效应蛋白的活性,都可以达到调控Rac1蛋白活性的目的。RNA干扰是通过实验手段向细胞内导入一段双链RNA（dsRNA）,宿主细胞对这段dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer,将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA—siRNA,这些siRNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型,从而达到某些实验或治疗目的。在本课题中,我们先以结直肠癌组织蜡块及新鲜结直肠癌组织为研究对象,用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法分别检测Rac1蛋白及Rac1 mRNA在上述组织中的表达情况,初步探讨Rac1与结直肠癌的关系;然后再以结直肠癌细胞株为研究对象,用RNAi方法将Rac1基因沉默,观察Rac1基因沉默后结直肠癌细胞骨架、侵袭移动能力以及细胞凋亡和细胞周期的变化,以期为今后基因治疗结直肠癌提供理论依据。第一部分Rac1在结直肠肿瘤中的表达及其临床意义目的:观察Rac1 mRNA和Rac1蛋白在人结直肠肿瘤组织中的表达,探讨Rac1基因与结直肠肿瘤的关系及与结直肠癌临床病理的关系。方法:收集已确诊的人结直肠癌组织蜡块、结直肠腺瘤蜡块和正常结直肠组织蜡块,采用免疫组化方法检测Rac1蛋白在上述组织中的表达情况。再收集新鲜的结直肠癌组织、结直肠腺瘤和正常结直肠组织,用RT-PCR和Western blot方法分别检测上述组织中Rac1 mRNA和Rac1蛋白的表达情况。结果:Rac1蛋白在结直肠癌组织中呈现高表达,在结直肠腺瘤组织中弱阳性表达,而在正常结直肠组织中低表达,经Kruskal-Wallis检验,三种组织中Rac1蛋白表达的差异有统计学意义（x²=126.69,P=0.000）;经进一步分析显示,Rac1蛋白与结直肠癌组织分化程度、Duke分期和淋巴结转移关系密切相关（分别为r=0.281,P=0.015;r=0.350,P=0.002;r=0.314,P=0.006）。新鲜组织中,结直肠癌组织Rac1 mRNA呈高表达,结直肠腺瘤组织中Rac1 mRNA弱阳性表达,正常结直肠组织中Rac1 mRNA低表达。经One Way ANOVA分析,三种新鲜结直肠组织Rac1 mRNA对应灰度值的表达,差异有统计学意义（F=1065.84,P=0.000）;Western blot检测的三种新鲜组织中Rac1蛋白对应灰度值,其差异也有统计学意义（F=540.88,P=0.000）,进一步说明Rac1在上述三种结直肠组织中表达有差异性。结论:Rac1可以作为评价结直肠癌恶性程度有价值的指标;Rac1与结直肠癌组织分化程度、Duke分期和淋巴结转移情况密切相关,而与患者年龄、性别、肿瘤发生的部位及肿瘤的大小无相关性。第二部分Rac1在结直肠癌细胞中的表达及沉默Rac1基因LoVo细胞株的构建目的:检测Rac1 mRNA和Rac1蛋白在人结直肠癌细胞株中的表达,构建稳定转染Rac1-shRNA表达载体质粒的LoVo细胞株,探讨Rac1与人结直肠癌细胞体外增殖的关系。方法:用RT-PCR和Western blot方法分别检测5种结直肠细胞株（LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29）中Rac1 mRNA和Rac1蛋白的表达情况;将Rac1-shRNA表达载体质粒转染LoVo细胞,构建稳定转染Rac1-shRNA表达载体质粒的LoVo细胞株;用MTT实验和细胞平板克隆实验,观察LoVo^Rac1-shRNA细胞株细胞增殖情况。结果:Rac1 mRNA和Rac1蛋白在5种结直肠癌细胞中均有高表达。成功构建了稳定转染Rac1-shRNA表达载体质粒的LoVo细胞株;用RT-PCR和Westernblot检测转染后LoVo细胞,Rac1 mRNA和Rac1蛋白表达明显下降,MTT实验和细胞平板克隆实验提示,LoVo^Rac1-shRNA细胞株细胞增殖速度变慢。结论:Rac1蛋白在5种结直肠癌细胞株中呈高表达;Rac1基因对LoVo细胞体外增殖有促进作用,沉默Rac1基因,可使LoVo细胞增殖速度变慢。第三部分Rac1与LoVo细胞侵袭移动的关系目的:检测Rac1 mRNA和Rac1蛋白在LoVo细胞转染Rac1-shRNA质粒后的表达情况;观察LoVo细胞Rac1基因沉默后,LoVo细胞形态和细胞骨架的变化以及Rac1基因沉默后和Rac1基因增强后,LoVo细胞侵袭移动的变化,探讨Rac1基因与细胞形态和细胞侵袭移动的关系。方法:RT-PCR和Western blot分别检测LoVo细胞转染Rac1-shRNA质粒后,Rac1 mRNA和Rac1蛋白在LoVo细胞的表达情况,并观察LoVo细胞肌动蛋白（F-actin）和细胞伪足的变化;再将Rac1抑制性质粒（Rac1-N17）及Rac1活化性质粒（Rac1-L61）分别转染LoVo细胞,观察LoVo细胞侵袭移动的变化。结果:LoVo细胞转染Rac1-shRNA表达载体质粒后,Rac1 mRNA和Rac1蛋白表达明显下降;转染后的LoVo细胞与对照组相比,细胞交联的F-actin网形成明显减少且紊乱,细胞膜伪足形成减少或看不到。单层细胞划痕24 h后,与对照组比较,Rac1-shRNA组和Rac1-N17组细胞迁移数明显减少,Rac1-L61组细胞迁移数增加,各组细胞迁移数分别是:106±8（Rac1/shRNA组）、117±11（Rac1/N17组）、369±15（Rac1/L61组）、316±12（Control组）。经OneWay ANOVA分析,各组间细胞迁移数差异有统计学意义（F=146.4,P=0.000）。细胞侵袭试验中,各组细胞迁移数计数分别为:34±4（Rac1/shRNA组）、42±5（Rac1/N17组）、86±7（Rac1/L61组）、73±6（Control组）。经One Way ANOVA分析,各组间细胞迁移数差异有统计学意义（F=48.55,P=0.000）。结论:1.RNA干扰沉默Rac1基因,可以:①抑制LoVo细胞交联的F-actin网的形成和细胞膜伪足的形成;②抑制LoVo细胞侵袭移动能力。2.Rac1基因上调,可以增加LoVo细胞侵袭移动能力。第四部分Rac1与LoVo细胞周期和细胞凋亡的关系目的:观察Rac1-shRNA表达载体质粒转染LoVo细胞后,LoVo细胞Rac1mRNA和Rac1蛋白的变化;探讨Rac1基因沉默后,Rac1基因与LoVo细胞周期和细胞凋亡的关系。方法:LoVo细胞转染Rac1-shRNA表达载体质粒后,用RT-PCR和Westernblot方法检测Rac1 mRNA和Rac1蛋白表达情况;实验分为Rac1-shRNA组、Control组和Mock组,收集LoVo细胞,用PI单染的方法,流式细胞仪检测LoVo细胞周期的变化;用Annexin V-FITC & PI双染的方法,流式细胞仪检测LoVo细胞凋亡情况。结果:LoVo细胞转染Rac1-shRNA表达载体质粒后,Rac1 mRNA和Rac1蛋白表达明显下降;流式细胞仪检测结果显示,细胞周期受阻于G₀-G₁期,G₀-G₁期细胞所占比例明显增加（74.63±4.40）,而S期细胞所占比例减少（13.20±1.77）。经One Way ANOVA分析,三组间在G₁期差异有统计学意义（F=26.256,P=0.001）;在S期差异也有统计学意义（F=78.893,P=0.000）。细胞凋亡检测,Rac1-shRNA组细胞凋亡百分数为0.251±0.026,而Control组和Mock组分别为0.094±0.011和0.098±0.013,经One Way ANOVA分析,三组相比较,LoVo细胞凋亡百分数差异有统计学意义（F=62.786,P=0.000）。结论:RNA干扰沉默Rac1基因可使Rac1蛋白不表达,导致:①大肠癌LoVo细胞的细胞周期进程受抑制,LoVo细胞受阻于G₀-G₁期;②LoVo细胞的凋亡明显增加。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-20
前言  20-35
  一、Rac1蛋白的生物学特性  20-21
  二、Rac1蛋白与细胞骨架  21-22
  三、Rac1蛋白与细胞周期和细胞凋亡  22-23
  四、Rac1蛋白与恶性肿瘤的转化和进展  23-24
  五、Rac1蛋白抑制剂与抗肿瘤治疗  24-26
  六、RNA干扰在大肠癌侵袭转移中的应用  26-27
  七、结语  27-28
  参考文献  28-35
第一部分 Rac1在结直肠肿瘤中的表达及其临床意义  35-52
  引言  35
  一、材料与方法  35-43
    (一) 材料  35
    (二) 主要试剂及配制  35-37
    (三) 主要设备  37-38
    (四) 方法  38-42
    (五) 统计方法  42-43
  二、结果  43-48
  三、讨论  48-50
  四、结论  50-51
  参考文献  51-52
第二部分 Rac1在结直肠癌细胞中的表达及构建稳定表达Rac1基因沉默的LoVo细胞株  52-81
  引言  52
  一、材料与方法  52-64
    (一) 材料  52-54
    (二) 主要试剂配制  54-55
    (三) 主要设备  55-56
    (四) 方法  56-64
    (五) 统计方法  64
  二、结果  64-76
  三、讨论  76-79
  四、结论  79
  参考文献  79-81
第三部分 Rac1与LoVo细胞侵袭移动的关系  81-102
  引言  81
  一、材料与方法  81-88
    (一) 材料  81-82
    (二) 主要试剂与配制  82
    (三) 主要设备  82-83
    (四) 方法  83-88
    (五) 统计学方法  88
  二、结果  88-95
  三、讨论  95-99
  四、结论  99
  参考文献  99-102
第四部分 Rac1与LoVo细胞周期和细胞凋亡的关系  102-118
  引言  102
  一、材料与方法  102-107
    (一) 材料  102-103
    (二) 主要试剂配制  103-104
    (三) 主要设备  104
    (四) 方法  104-107
    (五) 统计方法  107
  二、结果  107-112
  三、讨论  112-115
  四、结论  115
  参考文献  115-118
全文小结  118-119
英文缩写词表  119-121
攻读学位期间成果  121-122
致谢  122-124
统计学证明  124

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