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利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建

作　者: 田荣欢
导　师: 刘迪秋
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: CMV RNAi 遗传转化抗病毒岷江百合
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在农业生产中,病毒病害是仅次于真菌的第二大病害,每年对农业经济造成了巨大的损失。传统的病毒病防治措施主要包括：(1)农业的综合防治；(2)弱毒株系交叉保护防治植物病毒；(3)施用化学农药。这些方法都存在一些局限性和弊端,不能从根本上解决病毒病害问题。目前,随着植物基因工程技术的发展,基因沉默已发展为防治植物病毒病害的重要措施。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,可以调节和关闭基因的表达,进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi普遍存在于真核生物中,是植物应对外来病毒入侵的一种防御机制,在同一个启动子后面同时克隆目标基因的正义序列与反义序列,中间用一个内含子隔开。转录后的RNA自我配对形成一个反向重复序列,即发夹RNA (hairpin RNA, hpRNA)结构,发夹茎部能够形成稳定的dsRNA可诱导发生基因沉默。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)属于典型的三分体正义单链RNA病毒。CMV是危害最严重的病毒之一,具有重要的研究价值。本研究首先从云南省呈贡县采集带病毒症状的百合病叶,通过RT-PCR扩增获得CMV RNA1及RNA2的部分基因片段,并进行测序。其中扩增的1α基因片段长344bp,2α基因片段长308bp,序列比对表明,克隆的基因分别与CMV1a及2α高度同源。本研究采用高通量表达载体pHellsgate2,利用带有attB接头的引物对CMV1a及2α基因片段进行PCR,并通过BP反应将PCR产物构建pHellsgate2载体上。利用电转化法将RNAi表达载体转入农杆菌LBA 4404,经过农杆菌介导的遗传转化法将RNAi载体转入烟草中并表达。基因组DNA PCR检测得到CMV 1a转基因烟草阳性株41株,CMV 2a转基因烟草阳性株132株。以转基因阳性株为材料,进行CMV抗性分析。实验结果表明,1α及2a RNAi载体转基因烟草对CMV的抗性较野生型明显增强。接种CMV的野生型烟草叶片出现扭曲,失去光泽,叶色浓淡不均,并出现黄绿相间的花叶症状,而转基因烟草叶片个别表现轻微的花叶症状,大部分没有CMV感染的症状。经过RT-PCR检测,20株1a RNAi载体转基因烟草中,有12株表现出CMV抗性,而接种CMV的40株2a RNAi载体转基因烟草中,有21株表现出CMV抗性。这说明CMV 1a和2α双链RNA在烟草中的表达使转基因烟草对CMV侵染产生了不同程度的抗性。岷江百合(Lilium regale)又名王百合,是我国特有品种。岷江百合的抗逆性很强,是很好的遗传育种资源。本研究初步建立了根癌农杆菌介导的岷江百合遗传转化方法。本实验通过GUS基因的瞬时表达,对农杆菌介导的岷江百合遗传转化体系参数进行了优化。最终确定岷江百合的最优转化参数为：农杆菌的最适菌液浓度OD600为1.0,侵染时间为25-30min;共培养时温度为23℃；共培养时间为48h；共培养基中AS浓度为100mg/L,去NH4NO3。在瞬时表达的基础上进行了稳定表达,进一步摸索了岷江百合的遗传转化体系。在检测的36株转基因岷江百合中,有31株为阳性。

全文目录

摘要 4-6ABSTRACT 6-12插图和附表清单 12-14缩略词 14-15第一章文献综述 15-30 1.1 植物病毒病的研究进展 15-20 1.1.1 植物病毒病的危害 15-16 1.1.2 病毒侵染机制 16-17 1.1.3 黄瓜花叶病毒 17-19 1.1.4 植物病毒病的主要防治方法 19-20 1.2 RNAi在植物抗病毒应用中的研究进展 20-25 1.2.1 RNAi的机制 20-22 1.2.2 病毒抑制PTGS的作用方式 22-23 1.2.3 dsRNA引发的基因沉默 23-24 1.2.4 RNAi技术的应用 24-25 1.3 百合遗传转化的研究进展 25-29 1.3.1 百合组织培养 25-26 1.3.2 农杆菌介导的遗传转化 26-27 1.3.3 GUS与NPTII在遗传转化中的应用 27-28 1.3.4 植物基因工程在百合上的应用 28-29 1.4 本课题的研究意义与目的 29-30第二章 CMV复制酶基因1α及2α的分子克隆及RNAi载体的构建 30-47 2.1 前言 30 2.2 材料 30-34 2.2.1 病毒材料 30-31 2.2.2 菌株和载体 31-33 2.2.3 主要试剂 33 2.2.4 缓冲液配方 33-34 2.3 方法 34-40 2.3.1 百合病叶组织RNA提取及纯化 34 2.3.2 cDNA逆转录 34 2.3.3 PCR反应 34-36 2.3.4 T-A克隆 36 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的热刺激转化 36-37 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳 37 2.3.7 SDS碱裂解法提取并纯化质粒 37-38 2.3.8 PMD-18T-CMV1α及2α的PCR检测 38 2.3.9 BP重组反应 38 2.3.10 RNAi载体的酶切检测 38-39 2.3.11 制备农杆菌感受态细胞 39 2.3.12 电转化法转化农杆菌感受态细胞 39 2.2.13 PCR检测 39-40 2.4 结果与分析 40-45 2.4.1 CMV复制酶基因1α和2α的克隆 40-42 2.4.2 核苷酸序列的同源性分析 42 2.4.3 RNAi载体的构建 42-44 2.4.4 RNAi植物表达载体转化农杆菌 44-45 2.5 讨论 45-47第三章遗传转化及CMV抗性分析 47-58 3.1 前言 47 3.2 材料 47-49 3.2.1 植物材料 47-48 3.2.2 主要试剂 48 3.2.3 CMV材料 48 3.2.4 缓冲液和培养液配方 48-49 3.3 方法 49-52 3.3.1 遗传转化 49-50 3.3.2 CTAB法提取植物总DNA 50 3.3.3 引物设计 50-51 3.3.4 PCR检测 51 3.3.5 黄瓜花叶病毒粗提液的制备 51-52 3.3.6 转基因植株接种病毒 52 3.3.7 RNA的提取 52 3.3.8 RT-PCR检测 52 3.4 结果与分析 52-56 3.4.1 转基因植物的PCR检测 52-54 3.4.2 转基因烟草接种病毒 54-56 3.5 讨论 56-58第四章岷江百合遗传转化体系的初步建立 58-71 4.1 前言 58 4.2 材料和试剂 58-60 4.2.1 植物材料 58 4.2.2 菌株和载体 58-59 4.2.3 主要试剂 59 4.2.4 缓冲液和培养基配方 59-60 4.3 方法 60-62 4.3.1 GUS染色 60 4.3.2 岷江百合农杆菌侵染参数的优化 60-61 4.3.3 CTAB法提取岷江百合基因组DNA 61 4.3.4 引物设计 61-62 4.3.5 PCR反应 62 4.4 结果与分析 62-70 4.4.1 农杆菌侵染参数的优化 62-68 4.4.2 转基因岷江百合的的基因组PCR检测 68-70 4.5 讨论 70-71第五章结论与展望 71-73 5.1 结论 71-72 5.2 展望 72-73致谢 73-74参考文献 74-82附录A 攻读硕士期间发表论文目录 82

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