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人sTRAIL原核分泌表达载体的构建、表达及活性研究

作　者: 杨峰丽
导　师: 赵良启；赵邑
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: sTRAIL 重组表达载体细胞凋亡
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病。目前治疗恶性肿瘤主要采取手术、化疗和放疗三大传统疗法,虽然能清除大部分的肿瘤细胞,但仍有部分抗性细胞残余导致肿瘤复发,同时也对正常细胞产生较大的毒副作用,因此对肿瘤的治疗就成为当今的一大难题,寻找更为有效的抗肿瘤药物是目前的研究热点。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,简称TRAIL)是人体内正常表达的一种蛋白,是TNF超家族中的一名新成员。TRAIL蛋白能特异性地与肿瘤细胞表面的死亡受体结合诱导细胞凋亡,而不能诱导正常组织和细胞凋亡。基于这一优点,有望成为新型有效的治疗肿瘤药物,是目前肿瘤治疗中的研究热点。人TRAIL分子,基因编码281个氨基酸,从第95位或104位残基开始克隆可溶性分子TRAIL (sTRAIL)构建重组表达载体,表达出的蛋白均有活性。活性部位位于第114-281位氨基酸,是目前发现的可溶性、无毒副作用及生物学活性兼具的长度,因此本文选取第114-281位氨基酸片段作为研究对象。从HL-60(急性髓细胞性白血病细胞系)中提取总RNA,根据GeneBank提供的人TRAIL基因序列设计扩增人可溶性TRAIL基因114-281位氨基酸片段的特异性引物,同时引入限制性核酸内切酶Ncol、BamHI和TEV蛋白酶的酶切位点及His标签的基因序列,并将目的基因克隆至表达载体PhoA,成功构建分泌型重组表达载体phoA-sTRAIL,经Ncol、 BamHI酶切鉴定和测序分析,在大肠杆菌MM294中诱导表达。经Ni柱纯化,还原性SDS-PAGE和非还原性SDS-PAGE进行分析。结果表明本文所获取的蛋白以二聚体的形式存在。经western blot鉴定,在27KD处有一特异性条带,正是目的蛋白sTRAILL。分别以三种肿瘤细胞,即非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2和慢性髓细胞性白血病细胞株K562,为试验细胞株进行了sTRAIL蛋白的生物活性检测,结果显示sTRAIL蛋白能有效的抑制非小细胞肺癌细胞株A549和人肝癌细胞株HepG2的增殖,抑制率分别为46.7%和29.3%,对白血病细胞株K562的增殖抑制不明显。可以看出,sTRAIL有望成为新型的临床治疗肺癌的用药,同时也为今后的研究工作提供了科学的依据。

人sTRAIL原核分泌表达载体的构建、表达及活性研究

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