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PEDF蛋白对子痫前期发病影响的研究

作　者: 吴英
导　师: 余艳红
学　校: 南方医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子痫前期色素上皮衍生因子血管内皮生长因子微血管密度缺氧滋养细胞凋亡增殖侵袭质粒转染
分类号: R714.244
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景妊娠期高血压疾病是妊娠期特发的全身性疾病,我国发病率9.4%,国外报道7%-12%,迄今为止仍然是母婴发病率及死亡率较高的主要原因。子痫前期(preeclampsia)是该疾病最常见的类型,流行病学调查结果显示,子痫前期的发病率约为5-10%,疾病的病因及发生发展过程还不是十分明确,目前主要认为免疫失衡机制,胎盘浅着床,血管内皮细胞损伤和胎盘滋养细胞缺血、胰岛素抵抗、钙平衡失调等机制可能具有重要的作用。有研究认为,子痫前期患者存在子宫蜕膜血管重铸障碍,绒毛的数量减少、绒毛内的血管发育不良及间质纤维化等,胎盘缺血缺氧,引起广泛的血管内皮细胞的损伤,最终导致多器官、多系统功能损害。而正常胎盘血管床生成依赖于胎盘内血管生成诱导因子与抑制因子的复杂联系。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是目前已知最强的血管生成抑制剂,它是一种分子量大小约为50kDa的分泌型糖蛋白。PEDF不仅可以抑制新生血管的形成,还可逆转已经形成的血管。而且其抑制血管生成的活性具有明显的选择性,它可抑制生成病理性血管,但不影响生理性血管的形成。目前研究发现,PEDF是一种多功能蛋白,广泛分布于成人和胎儿多种组织(如眼、脑、肝、脂肪、肌肉、胎盘、卵巢、子宫内膜组织等等),具有营养神经、抗血管生成、抗血管的通透性、抗氧化、抗肿瘤生成、调节脂肪细胞及胰岛素生成等特性。2008年美国Beth等学者发现PEDF在正常妊娠妇女的脉管系统和胎盘的滋养层高度表达,很可能就是胎盘血管形成过程的静止因子,对维持血管的静止状态和确保正常血管的完整性具有重要作用。以往的大量研究表明,整个妊娠时期母体的胎盘组织以及血清中都可能有血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)表达。VEGF是一种有效的血管生成诱导物,VEGF与其受体结合后可通过旁分泌途径调控血管内皮细胞分化,促进内皮细胞的增生、迁移与浸润,同时VEGF可增加血管的通透性,造成大量血浆蛋白外渗,提供了促进血管生成所需要的暂时性基质。VEGF还能诱导内皮细胞中具有抗凋亡作用的Bcl-2的表达,抑制内皮细胞的凋亡,可见,VEGF在促进血管形成和维持血管内皮细胞的功能方面具有重要的作用,VEGF在胚胎着床、胎盘血管发育的过程中也非常关键。正常妊娠早期胎盘组织以及血清中VEGF水平都处于相对升高的状态,可能一方面因为妊娠早期滋养细胞处于相对缺氧状态,低氧通过一系列信号转导通路,刺激VEGF水平上调,另一方面,在胎儿及胎盘生长发育过程中,需要充足血液和血氧供应,VEGF的表达增加是为了适应妊娠的生理改变。研究认为孕早期VEGF水平下降与子痫前期发病密切相关,子痫前期患者胎盘组织中和母体外周血清中VEGF水平明显下降,可能是子痫前期的发病因素之一。PEDF能够通过作用于Fas/FasL介导的信号转导通路,诱导血管内皮细胞的凋亡,从而抑制血管新生；此外,PEDF还可抑制血管紧张素Ⅱ对VEGF的上调,可见,PEDF是VEGF天然的负性调节剂。PEDF是否类似于VEGF也参与子痫前期的发病过程,目前尚未见文献报道。正常妊娠时胚泡着床到子宫内膜及子宫肌层的过程主要由分化完全的滋养细胞来实现的,对滋养细胞的严密调控在形成正常的胎盘形成中非常重要,这一过程受到许多细胞因子、粘附分子、激素、氧张力等精确的调节,滋养细胞的功能异常是一系列病理妊娠的重要原因,尤其是胎儿宫内生长受限及子痫前期,其中子痫前期又被称为滋养细胞功能障碍疾病。人早孕绒毛滋养细胞是一种具有侵袭和破坏能力的细胞,类似于肿瘤细胞,但不具有肿瘤细胞的成瘤特性和转移能力。研究已表明,滋养细胞的迁移、侵袭能力的下降可能是子痫前期形成的一个重要原因。文献报道,PEDF能通过下调基质金属蛋白酶(MMP-9)的表达水平,以降低肿瘤细胞的侵袭性,从而具有抗肿瘤的功效。目前研究也证实了MMP-9基因的表达下降,能够降低滋养细胞侵袭能力,与子痫前期的发病密切相关。但PEDF是否能够通过类似的作用机制降低滋养细胞的侵袭能力,是否参与子痫前期的发病过程,这一切都需进一步验证。因此,我们推测色素上皮衍生因子(PEDF)很可能在子痫前期发病中发挥重要作用,且其对子痫前期发病影响的研究,目前国内外尚未见报道。故本课题从影响胎盘血管床生成因素为切入点,研究子痫前期患者胎盘中PEDF蛋白的表达情况,及其与胎盘组织中血管内皮生长因子(VEGF)及胎盘微血管密度的关系；并进一步从滋养细胞层面上研究PEDF蛋白在体外培养的缺氧的滋养细胞中的表达特点,及缺氧诱导后滋养细胞功能的变化；通过将构建的载有PEDF基因的质粒转染到滋养细胞中,研究PEDF对滋养细胞功能的影响,从而探讨PEDF对子痫前期发病的影响,为进一步寻找子痫前期的发病原因及机理提供基础。第一部分PEDF蛋白在子痫前期与正常妊娠胎盘组织中的表达[目的]探讨色素上皮衍生因子(PEDF)、血管内皮生长因子(VEGF)在子痫前期患者胎盘组织的表达及其与胎盘血管病变的关系。[方法]随机选取2011年10月至2013年1月南方医院住院分娩的子痫前期患者60例(其中子痫前期轻度mPE组30例,子痫前期重度sPE组30例)为研究对象,同期分娩的健康孕妇40例作为对照组,用western blot、免疫荧光组织化学双重标记方法检测子痫前期患者和正常妊娠妇女(对照组)胎盘组织中PEDF、VEGF的表达,并通过免疫荧光方法计数胎盘微血管密度(MVD),同时进行相关性分析。采用完全随机设计资料的多组样本均数比较的单因素方差分析(Oneway-Anova),两两比较用LSD(least significant difference)检验,指标间采用双变量相关分析中的pearson相关分析。[结果](1)胎盘的滋养细胞和血管内皮细胞中均表达PEDF、VEGF,主要表达于胞质及胞膜上,且两个因子表达位置大体相同。(2)子痫前期各组患者胎盘组织中PEDF阳性表达高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而且sPE组PEDF阳性表达高于mPE组(P<0.05)；(3)与正常对照组相比,子痫前期轻度组和子痫前期重度组患者胎盘组织中VEGF表达减少,分别为0.0840±0.1006,0.0785±0.0748,0.0767±0.0738,差异有统计学意义(P<0.05),而mPE组与sPE组VEGF表达无差异(P>0.05)；(4)正常对照组,mPE组,sPE组MVD计数依次递减,分别为136.06±9.07,106.40±8.51,92.65±7.89。子痫前期各组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),mPE组与sPE组差异有统计学意义P<0.05)；(5)子痫前期各组和正常对照组胎盘组织中PEDF表达与VEGF表达及MVD计数呈显著负相关(r=-0.365,P<0.05；r=-0.655,P<0.05),VEGF表达与MVD数值的变化则呈显著正相关(r=0.448,P<0.05)。[结论]PEDF与VEGF在胎盘的滋养细胞和血管内皮细胞中表达位置大体相同。PEDF蛋白在子痫前期患者胎盘组织中表达升高,而VEGF及MVD表达下降,后两者均与PEDF表达呈负相关。这提示PEDF可影响胎盘血管重铸,可能参与子痫前期的发生和发展过程。第二部分缺氧对滋养细胞中PEDF的表达及细胞功能的影响[目的]检测低氧浓度体外培养的人早孕绒毛滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞中PEDF蛋白及其mRNA表达的差异,并研究缺氧对滋养细胞功能的影响,以探求PEDF蛋白对子痫前期发病的影响。[方法]低氧浓度体外培养人早孕绒毛滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞,倒置显微镜观察缺氧对滋养细胞形态的影响,并采用细胞免疫荧光化学技术、实时荧光定量PCR检测各组滋养细胞中PEDF蛋白及mRNA表达的差异。用Tunnel法测定细胞凋亡情况,CKK-8法检测各组滋养细胞的增殖能力,Transwell板测定各组滋养细胞的侵袭能力。采用析因设计资料的方差分析,两组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test),指标间采用双变量相关分析中的spearman相关分析。[结果](1)在1%低氧浓度环境下体外培养HTR8/SVneo细胞的生长情况：HTR8-SVneo细胞对缺氧反应敏感,细胞形态发生明显的改变,细胞由多边形或梭形逐渐向圆形变化,突起变小,甚至部分消失。(2)细胞免疫荧光结果显示：PEDF蛋白在各组HTR8-Svneo细胞均有表达,其免疫反应产物表达主要定位于胞浆和胞膜中；与常氧组相比,缺氧24小时滋养细胞中PEDF蛋白的表达量无显著差异(P>0.05)；但缺氧48小时后,与常氧组相比,低氧组PEDF蛋白的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),且缺氧时间越长,PEDF蛋白升高更多(P<0.05)。(3)实时荧光定量PCR结果显示：与常氧组相比,低氧组PEDF mRNA表达水平在缺氧24小时差异不显著(P>0.05),但缺氧48、72小时PEDF mRNA表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧时间越长,PEDF mRNA表达越高(P<0.05)。以上结果表明缺氧对滋养细胞PEDF蛋白和其mRNA的表达呈时间依赖性。(4)Tunnel法测定滋养细胞凋亡：与常氧组相比,低氧组细胞凋亡数量在缺氧24、48小时无显著差异(P>0.05),但缺氧72小时细胞凋亡增多,差异有统计学意义(P<0.05)；(5)CKK-8法检测各组滋养细胞的增殖能力：各组滋养细胞的增殖能力无显著差异(P>0.05)。(6)Transwell测定滋养细胞侵袭能力：显微镜下可见各组均有数量不等的滋养细胞浸润至膜下室,与常氧组相比,1%低氧组滋养细胞在培养48、72小时浸润至膜下室的细胞减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(7)各组HTR-8/SVneo细胞中PEDF蛋白表达、mRNA表达均与凋亡的滋养细胞呈显著正相关(r=0.772,P<0.05；r=0.839,P<0.05),PEDF蛋白表达与mRNA表达呈显著正相关(r=0.876,P<0.05)。(8)各组HTR-8/SVneo中PEDF蛋白表达与滋养细胞侵袭能力呈显著负相关(r=-0.615,P<0.05)。[结论]我们结果提示缺氧环境能导致HTR8-SVneo滋养细胞中PEDF蛋白及mRNA表达增加,且随着缺氧时间的延长,PEDF表达呈显著增多趋势。缺氧可诱导滋养细胞的凋亡,而且明显抑制HTR8-SVneo滋养细胞的侵袭力,并随着缺氧时间的延长其侵袭能力进一步下降。但缺氧对滋养细胞的增殖影响不大。第三部分载有PEDF基因的质粒转染到滋养细胞对滋养细胞增殖侵袭能力的影响[目的]构建载有PEDF基因的质粒(pcDNA-PEDF),并将其转染到人早孕绒毛滋养细胞中,研究PEDF对滋养细胞凋亡、增殖与侵袭功能的影响。[方法]将构建好的载有PEDF基因的质粒(pcDNA-PEDF)转染到人早孕绒毛滋养细胞中,通过细胞免疫荧光及实时荧光定量PCR,观察转染后24小时滋养细胞中PEDF蛋白及mRNA表达情况；并用Tunnel法测定细胞凋亡,CKK-8法检测各组滋养细胞的增殖能力,Transwell板测定各组滋养细胞的侵袭能力。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两比较用LSD(least significant difference)检验,相关分析采用双变量的spearman相关分析.[结果](1)与正常对照组相比,转染PEDF质粒24小时后,HTR-8/SVneo滋养细胞中PEDF蛋白及PEDFmRNA表达增多,差异有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；(2)与正常对照组相比,转染PEDF基因质粒的滋养细胞组的细胞凋亡增多,分别为9.67±1.52、15.67±2.52,差异有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；(3)转染PEDF基因质粒后,各组HTR-8/SVneo滋养细胞生长增殖无显著差异(P>0.05)；(4)与正常对照组相比,转染PEDF基因质粒的滋养细胞进入Transwell膜下室的细胞数降低,分别为39.00±4.58、20.33±2.52,差异有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；(5)PEDF蛋白表达、mRNA表达均与凋亡的滋养细胞呈显著正相关(r=0.970,P<0.05；r=0.745,P<0.05),PEDF蛋白表达与mRNA表达呈显著正相关(r=0.672,P<0.05)；(6)PEDF蛋白表达与滋养细胞侵袭能力呈显著负相关(产-0.882,P<0.05)。[结论]PEDF对维持正常的人早孕绒毛滋养细胞功能非常重要,PEDF表达增多,可增加滋养细胞的凋亡,降低滋养细胞的侵袭能力,且PEDF蛋白表达水平与滋养细胞的侵袭能力呈显著负相关。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-22
前言  22-31
第一部分 PEDF蛋白在子痫前期与正常妊娠胎盘组织中的表达  31-52
  材料与方法  31-41
  结果  41-48
  讨论  48-52
第二部分缺氧对滋养细胞中PEDF的表达及细胞功能的影响  52-75
  材料与方法  52-62
  结果  62-70
  讨论  70-75
第三部分载有PEDF基因的质粒转染到滋养细胞对滋养细胞增殖侵袭能力的影响  75-94
  材料与方法  75-85
  结果  85-91
  讨论  91-94
参考文献  94-104
中英文缩略词对照表  104-105
成果  105-106
致谢  106-108
统计审稿证明  108

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