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IGFBP-6对缺氧诱导性血管生成的作用研究

作　者: 张春阳
导　师: 李筠
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 缺氧血管生成 IGFBP-6 斑马鱼实体瘤
分类号: Q46
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

O₂是多数生物体赖以生存的代谢原料,在物种生存的自然环境中,缺氧是一种常见的现象。为了适应缺氧环境,生物体进化出了一系列感知并应激环境缺氧的机制。血管生成便是其中一种。缺氧是血管生成的重要刺激因子。目前发现的绝大多数缺氧参与的血管生成调控机制均为正反馈调节机制,即缺氧促进血管生成。而是否存在缺氧诱导性血管生成的负反馈调节机制,目前尚不清楚。IGF（insulin-like growth factor,胰岛素样生长因子）是体内重要的生长因子,它在组织细胞的增殖、分化、凋亡,机体的生长发育及肿瘤的发生、发展中起重要的调节作用。目前,大量的研究已经证实了IGF系统参与血管生成的调控过程。IGF和胰岛素在早期血管生成过程中起到应激或增强缺氧效应的作用。另一方面,IGF信号系统部分成员的基因表达也受缺氧调控。因此,本研究的目的之一是检测在血管内皮细胞中基因表达受缺氧调控的IGF信号系统分子,特别是6个结合蛋白IGFBP-1⁶。针对这一研究目的,我们以体外培养的大鼠脑微动脉血管内皮细胞为材料,用半定量RT-PCR的方法发现,大鼠脑微动脉血管内皮细胞仅表达6个结合蛋白中的IGFBP-6,且大鼠脑微动脉血管内皮细胞中IGFBP-6的基因表达受缺氧上调。我们以半定量RT-PCR以及实时荧光定量PCR的方法检测了人类脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）IGFBP-6的表达情况,检测结果证实HUVEC中IGFBP-6的基因表达同样受缺氧上调。在以上初步研究结果的基础上,我们从以下几个方面进行了深入研究:1)研究IGFBP-6基因表达受缺氧调控的机制;2)确定IGFBP-6在血管内皮细胞中表达的生理意义,即:IGFBP-6对于血管生成的调控作用;3)研究IGFBP-6影响血管生成的分子机制。研究方法包括:1)半定量RT-PCR和Real-Time PCR检测物理缺氧及CoCl2模拟的化学缺氧对血管内皮细胞IGFBP-6表达模式的影响;2)序列分析IGFBP-6启动子及增强子结构域内是否存在反式作用元件HRE及HAS序列;3)采用体外血管生成模型,通过Matrigel实验系统验证体外重组IGFBP-6蛋白对血管生成的影响及其IGF配体依赖性;4)以转基因斑马鱼flk1:gfp为模型验证IGFBP-6对于胚胎发育血管生成的影响;5)以异体移植实体瘤为肿瘤模型研究IGFBP-6对于肿瘤血管生成的影响;6)蛋白免疫印迹检测HIF-1转录因子复合物的激活情况以及血管生成相关信号通路的激活情况;7)利用信号通路特异性抑制剂及体外血管生成模型找到IGFBP-6抑制血管生成的信号通路。利用以上研究方法,我们发现:1)缺氧上调血管内皮细胞中IGFBP-6的基因表达,而且缺氧对IGFBP-6基因表达的调控作用可能是通过缺氧诱导性转录因子HIF-1来实现的;2)IGFBP-6能够抑制体外血管生成,这种抑制作用不依赖于IGFBP-6与IGF配体的结合;3)在体外血管生成模型中,IGFBP-6可以拮抗VEGF对血管生成的促进作用;4)在体内血管生成模型中,IGFBP-6既可以抑制斑马鱼胚胎的血管生成,也可以抑制裸鼠异体移植实体瘤的肿瘤血管生成;5)IGFBP-6对于斑马鱼胚胎血管生成的抑制作用具有进化上的保守性,因为斑马鱼Igfbp-6b同样能够抑制胚胎的血管生成,这与人类IGBFP-6的功能类似。以上研究结果证明,IGFBP-6可能是缺氧诱导性血管生成的一种负反馈调节因子,这是目前为止发现的首个缺氧诱导性血管生成的负反馈调节机制。这一发现将为肿瘤及血管生成相关疾病的治疗提供新的靶点。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
1. 前言  12-32
  1.1 血管形成  12-18
    1.1.1 血管生成概述  12-13
    1.1.2 血管生成调控网络  13-18
  1.2 缺氧与缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）  18-23
    1.2.1 缺氧与生物机能  18-20
    1.2.2 缺氧与缺氧诱导因子（HIF）的激活  20-22
    1.2.3 缺氧与血管形成  22-23
  1.3 IGF 系统与 IGFBP-6  23-28
    1.3.1 IGF 信号系统简介  23-25
    1.3.2 IGF 信号通路与血管形成  25-28
    1.3.3 IGFBP-6  28
  1.4 基于斑马鱼胚胎技术的血管形成研究  28-32
    1.4.1 斑马鱼胚胎技术  28-29
    1.4.2 斑马鱼胚胎血管形成  29-32
2. 材料和方法  32-43
  2.1 斑马鱼胚胎培养  32
  2.2 细胞培养及缺氧处理  32
  2.3 RNA 提取  32-33
  2.4 RT-PCR 及 Real-time PCR  33-36
    2.4.1 RT-PCR  33-34
    2.4.2 目的基因的 Real-time PCR 检测  34-36
  2.5 在斑马鱼胚胎中过表达IGFBP-6 对血管生成及胚胎生长发育的影响  36-38
    2.5.1 表达载体的构建  36
    2.5.2 mRNA 的体外合成  36-38
    2.5.3 显微注射  38
  2.6 裸鼠实体瘤血管形成实验(Gallicchio et al. 2001)  38-39
    2.6.1 Rh30 细胞的转染  38-39
    2.6.2 异体移植实验  39
  2.7 显微成像与数据分析  39
  2.8 体外血管形成实验（Matrigel assay）  39-40
  2.9 蛋白样品的免疫印迹分析  40-42
    2.9.1 蛋白样品的收集  40-41
    2.9.2 Western blotting  41-42
  2.10 数据统计与分析  42-43
3. 实验结果  43-59
  3.1 缺氧上调血管内皮细胞igfbp-6 的表达  43-45
  3.2 缺氧对血管内皮细胞igfbp-6基因表达的调控可能是通过HIF-1a来实现的  45-47
  3.3 人类IGFBP-6：GFP 过表达载体的构建及验证  47-49
  3.4 IGFBP-6 抑制 HUVEC 细胞在体外形成血管  49-50
  3.5 IGFBP-6 对血管形成的抑制作用不依赖于 IGF  50-51
  3.6 IGFBP-6 拮抗 VEGF 对血管形成的促进作用  51-54
  3.7 在体过表达IGFBP-6 抑制斑马鱼胚胎和裸鼠异体移植实体瘤的血管形成，且 IGFBP-6 的抑制血管生成作用具有进化保守性  54-56
  3.8 IGFBP-6 激活 HUVEC 细胞的Akt，p38 以及Erk1/2信号通路  56-57
  3.9 抑制 PI3K-Akt,MAPK-Erk1/2,MAPK-p38 信号通路未能营救IGFBP-6 造成的血管形成缺陷  57-59
4. 讨论  59-62
5. 总结  62-64
6. 展望  64-66
  6.1 缺氧上调 IGFBP-6 基因表达机制的深入阐明  64
  6.2 IGFBP-6 抑制体内血管生成是否依赖于IGF 配体结合力  64
  6.3 IGFBP-6 与 VEGF 共同作用的机制  64-65
  6.4 细胞内信号转导途径  65-66
参考文献  66-77
附录  77-79
致谢  79-80
个人简历  80-81
硕士期间发表论文  81

IGFBP-6对缺氧诱导性血管生成的作用研究

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