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叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究

作　者: 黄明钜
导　师: 李力
学　校: 广西医科大学
专　业: 妇科肿瘤学
关键词: 卵巢癌 多药耐药 叶酸结合蛋白 卵巢恶性肿瘤 免疫蛋白印迹 慢病毒表达载体 顺铂 细胞凋亡 细胞周期
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


第一章卵巢癌多药耐药的研究进展卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见的肿瘤,它是妇科三大恶性肿瘤之一,仅次于宫颈癌,宫体癌,居第三位。卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的80%,目前主要的治疗手段是手术治疗和铂类为基础的联合化疗,患者5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。大多数卵巢患者发现时已为中晚期,有的甚至已经失去了手术机会而给予非手术治疗,75%～80%的卵巢癌开始对化疗敏感,其余则表现为原发耐药,最终所有化疗患者至少80%出现耐药,而多药耐药机制极为复杂,目前还没完全清楚,卵巢癌多药耐药产生后治疗效果明显降低。预防和减少卵巢癌多药耐药的发生,以及对卵巢癌多药耐药的逆转治疗,是现阶段迫切需要解决的问题。国外有学者曾报道叶酸结合蛋白与卵巢癌的发生发展密切相关,在多药耐药中也扮演了重要的角色,具体机制暂未明确,需要我们进一步的研究探索。第二章卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义目的：探讨卵巢恶性肿瘤组织中叶酸结合蛋白(FOLR1)的表达及其临床意义。方法：采用Western Blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及30例正常卵巢组织中的FOLR1表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果：(1)FOLR1在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P<0.01)。(2)FOLR1在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化(P<0.05)。(3)FOLR1在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量低于铂类药物敏感型(P<0.01)；其在治疗后仍进展肿瘤中的表达量低于缓解者(P<0.01)。(4)FOLR1在粘液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P<0.05),在有淋巴结和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤中高于未有转移者(P<0.05),与患者的不同肿瘤病理分类、是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关(P>0.05)。(5)取FOLR1表达量界值为3.115时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤FOLR1表达量的高低与中位生存时间差别无明显相关(P>0.05),COX模型多因素分析显示FOLR1表达量不是影响患者生存预后的独立因素。结论：FOLR1在正常卵巢和卵巢良性肿瘤组织中的表达量低于卵巢恶性肿瘤,其可作为一种新型的卵巢恶性肿瘤早期诊断标志物。铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中FOLR1呈低表达,在铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤中高表达,提示FOLR1与卵巢恶性肿瘤多药耐药相关,可作为判断卵巢恶性肿瘤多药耐药潜在标志物之一。第三章FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定目的：构建携带叶酸结合蛋白基因(FOLR1)的慢病毒表达载体并进行表达鉴定。方法：PCR扩增FOLR1全长,克隆至pWPI载体质粒,重组阳性克隆行PCR和测序鉴定,重组质粒与其辅助质粒共同转染293T细胞包装病毒,病毒颗粒感染SKOV3细胞,流式分选,RT-PCR和Western Blot检测FOLR1的表达。结果：FOLR1正确克隆至pWPI载体质粒,PCR及测序证实重组表达载体构建成功,293T细胞成功包装慢病毒,pWPI-FOLR1慢病毒高效感染SKOV3细胞,RT-PCR和Western Blot检测出被感染后的SKOV3细胞中有FOLR1表达。结论：成功构建了FOLR1慢病毒表达载体,能高效感染SKOV3细胞,FOLR1基因转导后稳定表达,为下步探讨FOLR1在恶性卵巢肿瘤中的功能提供了实验基础。第四章FOLR1基因对顺铂作用卵巢癌上皮细胞生物学影响的体外实验研究目的：探索卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后对其生物学功能的影响以及作用途径。方法：MTT法测定三组细胞(SKOV3、pWPI-SKOV3、 pWPI-FOLR1-SKOV3)的生长增值情况、顺铂对三组细胞的IC50和不同顺铂浓度分别作用不同时间对三组细胞的抑制率；流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率；流式细胞术检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响；高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度。结果：实验组细胞(pWPI-FOLR1-SKOV3)与两组对照组相比较：(1)增殖速度明显升高、顺铂对其作用的IC50值降低。(2)顺铂对其生长抑制率增加(P<0.05),呈剂量-时间依赖关系,其对顺铂的敏感性增加。(3)顺铂更容易诱导其凋亡发生(P<0.05),呈时间-剂量依赖关系。(4)顺铂将其周期中的S期阻滞比例明显增加(P<0.05)。(5)细胞内的顺铂浓度增加近一倍。结论：FOLR1基因能增强卵巢癌SKOV3细胞的生长增殖能力；卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后顺铂对其抑制率增加,呈剂量-时间依赖关系,顺铂更容易诱导其凋亡发生,呈时间-剂量依赖关系,顺铂将其细胞周期中的S期阻滞明显增加,细胞内顺铂浓度升高。

全文目录


致谢  10-11
主要中英缩语  11-12
摘要  12-15
Abstract  15-19
第一章 卵巢癌多药耐药的研究进展  19-97
  1 卵巢恶性肿瘤概述  19-32
    1.1 卵巢恶性肿瘤的发病率及生存率  19
    1.2 卵巢恶性肿瘤可能的致病因素  19-21
      1.2.1 生殖内分泌因素  20
      1.2.2 家族遗传因素  20
      1.2.3 行为因素  20-21
      1.2.4 其他因素  21
    1.3 卵巢恶性肿瘤的主要临床表现及诊断  21-24
      1.3.1 主要临床表现  21
      1.3.2 卵巢上皮癌诊断的主要方法  21-24
        1.3.2.1 影像学检查  21-22
        1.3.2.2 血清肿瘤标记物  22-24
        1.3.2.3 腹腔镜检查  24
        1.3.2.4 细胞学检查  24
        1.3.2.5 组织病理学检查  24
    1.4 卵巢癌的分期  24-25
    1.5 卵巢癌常规治疗现况  25-32
      1.5.1 卵巢癌的手术治疗  26-28
        1.5.1.1 卵巢癌全面分期手术  26
        1.5.1.2 再分期手术  26
        1.5.1.3 肿瘤细胞减灭术  26-27
        1.5.1.4 中间型肿瘤细胞减灭术  27
        1.5.1.5 二次探查术  27
        1.5.1.6 再次肿瘤细胞减灭术  27
        1.5.1.7 保留生育功能的手术  27-28
      1.5.2 卵巢癌一线化疗模式及存在的问题  28-31
        1.5.2.1 卵巢癌一线化疗方案选择  28-29
        1.5.2.2 一线化疗方案总体疗效评价  29-30
        1.5.2.3 卵巢癌一线化疗存在的问题  30-31
      1.5.3 其他治疗  31-32
        1.5.3.1 放射治疗  31
        1.5.3.2 生物治疗  31-32
        1.5.3.3 内分泌治疗  32
        1.5.3.4 中医治疗  32
  2 卵巢癌多药耐药  32-36
    2.1 卵巢癌多药耐药的概念  32-33
    2.2 卵巢癌多药耐药的临床表现  33
    2.3 卵巢癌多药耐药的诊断  33-36
      2.3.1 清CA125对卵巢癌多药耐药的诊断价值  34-35
      2.3.2 清HE4对卵巢癌多药耐药的诊断价值  35
      2.3.3 其它肿瘤标志物对卵巢癌多药耐药的诊断价值  35-36
      2.3.4 新潜在的用于卵巢癌多药耐药诊断标志物筛选、鉴定和临床验证现况  36
  3 卵巢癌多药耐药发生的机理  36-47
    3.1 卵巢癌多药耐药发生的相关临床病理因素  37-38
      3.1.1 卵巢癌病理类型与多药耐药  37
      3.1.2 卵巢癌FIGO分期与多药耐药  37-38
      3.1.3 其它临床病理因素与多药耐药  38
    3.2 影响卵巢癌一线化疗疗效的相关临床病理因素  38-39
    3.3 卵巢癌多药耐药发生的分子机理  39-47
      3.3.1 细胞内化疗药物外排的机制  39-44
        3.3.1.1 P-糖蛋白与卵巢癌多药耐药  40-41
        3.3.1.2 多药耐药相关蛋白与卵巢癌多药耐药  41-42
        3.3.1.3 乳腺癌耐药蛋白与卵巢癌多药耐药  42-43
        3.3.1.4 肺耐药相关蛋白与卵巢癌多药耐药  43-44
      3.3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加的机制  44
      3.3.3 DNA损伤修复能力增加的机制  44-45
      3.3.4 信号传导通路障碍的机制  45-46
      3.3.5 细胞凋亡异常的机制  46
      3.3.6 其它机制  46-47
  4 卵巢癌多药耐药的治疗  47-70
    4.1 降低卵巢癌多药耐药发生的化疗对策探索  48-53
      4.1.1 一线标准方案中加入其它化疗药物的RCT结果  48-49
      4.1.2 一线标准方案用药途径改变的RCT结果  49-50
      4.1.3 一线标准方案用药强度及时间改变的RCT结果  50-51
      4.1.4 一线标准化疗完成后巩固化疗的RCT结果  51-52
      4.1.5 术前新辅助化疗的RCT结果  52-53
    4.2 卵巢癌多药耐药的预防  53-54
    4.3 卵巢癌多药耐药的临床分型及治疗目的  54-56
      4.3.1 卵巢癌多药耐药的临床分型  55-56
      4.3.2 卵巢癌多药耐药治疗目的  56
    4.4 卵巢癌多药耐药的手术治疗  56-59
      4.4.1 卵巢癌多药耐药患者手术的适应征与禁忌征  56-57
      4.4.2 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式与疗效评价  57-58
        4.4.2.1 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式  57-58
        4.4.2.2 卵巢癌多药耐药患者手术的疗效评价  58
      4.4.3 影响卵巢癌多药耐药患者手术疗效的临床病理因素  58-59
    4.5 卵巢癌多药耐药的化疗  59-64
      4.5.1 卵巢癌多药耐药患者化疗的适应征与禁忌征  59-60
      4.5.2 单纯的CA125升高是否适合化疗  60-61
      4.5.3 卵巢癌多药耐药患者化疗的方案选择与疗效评价  61-63
        4.5.3.1 卵巢癌多药耐药患者单药化疗及疗效评价  61-63
        4.5.3.2 卵巢癌多药耐药患者联合化疗及疗效评价  63
      4.5.4 影响卵巢癌多药耐药患者化疗疗效的临床病理因素  63-64
    4.6 卵巢癌多药耐药的靶向治疗  64-68
      4.6.1 EGFR拮抗剂  64
      4.6.2 血管生长阻滞剂  64-65
      4.6.3 信号转导抑制剂  65-66
      4.6.4 抗FRA人源化单克隆抗体  66
      4.6.5 mTOR抑制剂  66-67
      4.6.6 PARP抑制剂  67-68
    4.7 卵巢癌多药耐药的其它治疗  68-70
      4.7.1 抗肿瘤MDR基因治疗  68
      4.7.2 多药耐药的逆转耐药治疗  68-70
  5 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药关系的研究  70-76
    5.1 叶酸结合蛋白结构与生物学作用  70-71
    5.2 叶酸结合蛋白表达与肿瘤临床病理的相关性  71-72
    5.3 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药的关系  72-73
    5.4 针对叶酸结合蛋白为靶点肿瘤多药耐药治疗  73-75
      5.4.1 叶酸结合蛋白介导的叶酸偶联物的种类  74
      5.4.2 叶酸结合蛋白介导的肿瘤靶向纳米递药系统  74
      5.4.3 叶酸结合蛋白介导叶酸偶联物进入肿瘤细胞机制  74-75
    5.5 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药关系研究中存在的问题  75-76
  6 本研究的目的和意义  76
  参考文献  76-97
第二章 卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义  97-116
  1 前言  97
  2 材料与方法  97-104
    2.1 材料  97-100
      2.1.1 组织标本  97-98
      2.1.2 实验主要仪器设备  98-99
      2.1.3 主要试剂及配制  99-100
      2.1.4 器具处理  100
    2.2 方法  100-104
      2.2.1 实验原理  100-101
      2.2.2 实验方法及步骤  101-103
      2.2.3 整理数据及统计学分析  103-104
  3 结果  104-110
    3.1 FOLR1在正常卵巢、卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤组织中的表达情况  104-105
    3.2 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与临床病理因素的关系  105-106
    3.3 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与肿瘤转移及腹水量关系  106-107
    3.4 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与疗效和耐药的相关性  107-108
    3.5 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与患者预后的关系  108-110
  4 讨论  110-113
  参考文献  113-116
第三章 FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定  116-152
  1 前言  116
  2 材料与方法  116-141
    2.1 材料  116-121
      2.1.1 实验主要仪器设备  116-117
      2.1.2 主要试剂及配制  117-118
      2.1.3 细胞  118
      2.1.4 慢病毒系统  118-120
      2.1.5 FOLR1基因cDNA克隆质粒pOTB7  120-121
      2.1.6 引物及其序列  121
      2.1.7 器具处理  121
    2.2 方法  121-141
      2.2.1 重组表达载体质粒的构建  121-129
      2.2.2 重组表达载体质粒的PCR和测序鉴定  129-132
      2.2.3 慢病毒的包装及感染靶细胞  132-139
      2.2.4 慢病毒表达载体的鉴定  139-141
  3 结果  141-149
    3.1 FOLR1基因和pWPI载体质粒重组前准备的结果  141
    3.2 重组表达载体鉴定的结果  141-142
    3.3 慢病毒的包装的结果  142-145
    3.4 病毒滴度测定的结果  145-146
    3.5 慢病毒感染靶细胞的结果  146
    3.6 慢病毒感染SKOV3细胞后流式分选的结果  146-147
    3.7 RT-PCR法检测慢病毒感染SKOV3细胞后FOLR1基因表达的结果  147
    3.8 Western Blot检测慢病毒感染SKOV3细胞后FOLR1蛋白表达的结果  147-149
  4 讨论  149-150
  参考文献  150-152
第四章 FOLR1基因对SKOV3细胞生物学影响的体外实验研究  152-186
  1 前言  152
  2 材料与方法  152-163
    2.1 材料  152-154
      2.1.1 实验主要仪器设备  152-153
      2.1.2 主要试剂及配制  153-154
      2.1.3 器具处理  154
    2.2 方法  154-163
      2.2.1 实验分组  154
      2.2.2 MTT法测定三组细胞生长曲线  154-155
      2.2.3 MTT法测定顺铂对三组细胞的IC50  155-156
      2.2.4 MTT法检测不同顺铂浓度及其作用不同时间对三组细胞的抑制率  156-157
      2.2.5 流式检测不同顺铂浓度及其作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率  157-160
      2.2.6 流式检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响  160-162
      2.2.7 高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度  162-163
      2.2.8 整理数据及统计学分析  163
  3 结果  163-178
    3.1 MTT法测定三组细胞的生长曲线结果  163-164
    3.2 MTT法测定顺铂对三组细胞的IC50结果  164-165
    3.3 MTT法检测不同顺铂浓度及其作用不同时间对三组细胞抑制率结果  165-169
    3.4 流式检测不同顺铂浓度及其作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率  169-173
    3.5 流式检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响结果  173-177
    3.6 高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时胞内顺铂浓度的结果  177-178
  4 讨论  178-183
  参考文献  183-186
全文小结  186-187
全文创新点  187-188
本研究存在的问题  188-189
综述  189-196
  参考文献  194-196
学习期间发表的论文  196

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