学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

RNAi沉默Med19基因对人肺癌A549细胞生长、转移影响的实验研究

作　者: 李金东
导　师: 张兴义
学　校: 吉林大学
专　业: 外科学
关键词: 肺癌 Med19 RNAi 慢病毒表达载体
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 391次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的:探讨应用RNAi技术沉默Med19基因抑制人肺癌A549细胞生长、转移的效果。方法:①以Med19己知序列为靶点,构建siRNA-Med19重组慢病毒载体。②siRNA-Med19慢病毒表达载体与pCDNA3.1(-)- Med19过表达载体共转染293T细胞,Western blot外源筛选靶点。③将siRNA-Med19慢病毒表达载体转染人肺癌A549细胞株,应用Real-time PCR和Western blot检测Med19基因的转录水平及蛋白表达;应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰;应用MTT、基底膜侵袭实验、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、侵袭能力及细胞凋亡。④将siRNA-Med19慢病毒表达载体转染人肺癌A549细胞株,复制裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤组织体积及重量,连续病理组织切片, HE染色观察移植瘤及转移瘤结节,并计算各组转移瘤数目和转移率。结果:①成功构建siRNA-Med19重组慢病毒载体,并经基因测序证实。②成功构建目的基因过表达载体pCDNA3.1-Med19,并与siRNA-Med19重组慢病毒载体共转染293T细胞,Western blot外源验证靶点的有效性。③Real-time PCR及Western blot结果显示,转染siRNA-Med19慢病毒表达载体组中Med19的基因转录及蛋白表达水平明显降低。流式细胞术、MTT、基底膜侵袭实验、细胞克隆形成实验结果显示:siRNA-Med19慢病毒表达载体转染组抑制细胞增殖、侵袭,检测到细胞凋亡。④成功建立裸鼠移植人肺癌模型,siRNA-Med19慢病毒表达载体转染组肿瘤体积及重量均低于对照组。连续病理组织切片观察转染siRNA-Med19慢病毒表达载体组肝脏、肺脏转移率低、转移瘤数目少。结论:应用RNAi技术沉默Med19基因可以降低人肺癌A549细胞的转录、表达,导致细胞凋亡,抑制肿瘤的生长、侵袭及转移。

全文目录


提要  4-8
英文缩写词表  8-10
前言  10-12
第一章 文献综述  12-52
  第一节 Med19 与肿瘤研究进展  13-36
    1 Med 的发现及其结构  13-16
      1.1 Med 复合物的发现  13-14
      1.2 酵母Med 的结构  14-15
      1.3 哺乳动物的Med  15-16
    2 Med 的功能  16-21
      2.1 Med 和RNA 聚合酶Ⅱ之间的相互作用  16-17
      2.2 Med 与转录激活  17-18
      2.3 Med 与转录阻抑  18-19
      2.4 Med 对转录进行调节的机制  19-20
      2.5 Med 复合物在真核生物发育过程中的作用  20-21
    3 Med19 的功能  21-24
    4 Med19 与肿瘤  24-25
    5 Med19 与信号传导基因异常  25-28
    6 Med19 与代谢类相关基因异常  28-29
    7 Med19 与蛋白翻译合成类及其他表达差异基因异常  29-30
    8 细胞转录的分子机制  30-34
      8.1 原核细胞转录机制的研究  30-31
      8.2 真核细胞转录机制的研究  31-33
      8.3 RNA 聚合酶Ⅱ的转录过程  33-34
    9 Med19 小结与展望  34-36
  第二节 RNAi 的研究进展  36-52
    1 RNAi 的研究历史  36-37
    2 RNA 干扰的作用机制  37-39
      2.1 转录后抑制  38-39
      2.2 转录抑制  39
      2.3 翻译抑制  39
    3 RNAi 的作用特点  39-41
      3.1 高度的特异性  39
      3.2 高效性  39-40
      3.3 PTGS 机制  40
      3.4 高稳定性  40
      3.5 双干扰系统  40
      3.6 RNAi 的可扩散性  40
      3.7 抑制范围广  40-41
      3.8 RNAi 对细胞调控机制的影响  41
    4 RNAi 技术要点  41-46
      4.1 siRNA 的设计  41-42
      4.2 siRNA 的合成  42-43
      4.3 siRNA 导入细胞的方法  43-46
    5 RNAi 技术的应用  46-52
      5.1 基因功能研究  46-47
      5.2 制备RNAi 转基因动物  47
      5.3 临床应用  47-52
第二章 siRNA-Med19 慢病毒表达载体的构建与鉴定  52-82
  第一节 材料和方法  53-70
    1 材料  53-56
      1.1 主要试剂  53-54
      1.2 主要仪器  54-55
      1.3 质粒与菌株  55
      1.4 实验细胞  55
      1.5 抗体  55
      1.6 培养基  55-56
    2 实验方法  56-70
      2.1 siRNA-Med19 慢病毒载体的构建  56-61
      2.2 目的基因过表达载体构建pCDNA3.1(-)-Med19  61-64
      2.3 Western Blot 外源筛选有效靶点(protocol)  64-67
      2.4 有效靶点慢病毒大量包装及滴度测定  67-70
  第二节 实验结果  70-77
    1 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体的鉴定  70-72
      1.1 酶切pGCSIL-GFP 载体的琼脂糖凝胶电泳鉴定  70
      1.2 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体琼脂糖凝胶电泳鉴定  70-71
      1.3 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体测序鉴定  71-72
    2 目的基因过表达载体pCDNA3.1(-)- Med19 的鉴定  72-75
    3 Western blot 外源筛选靶点  75-76
      3.1 慢病毒载体共转染293T 细胞情况  75
      3.2 最佳靶点筛选情况  75-76
    4 siRNA-Med19 慢病毒载体的包装及滴度测定  76-77
  第三节 讨论  77-82
第三章 RNAi 沉默Med19 基因对人肺癌A549 细胞影响的体外实验研究  82-105
  第一节 材料和方法  83-93
    1 材料  83
      1.1 主要试剂  83
      1.2 主要仪器  83
    2 实验方法  83-93
      2.1 Real-time PCR 验证靶点的有效性(protocol)  83-86
      2.2 Western blot 验证靶点的有效性(protocol)  86-89
      2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡  89-90
      2.4 细胞生长抑制实验(MTT 比色实验法)  90-91
      2.5 细胞侵袭实验  91-92
      2.6 细胞克隆形成实验  92
      2.7 统计学处理  92-93
  第二节 结果  93-102
    1 细胞生长状况的观察  93
    2 Real-time PCR 检测转录影响  93-96
      2.1 慢病毒载体对人肺癌A549 细胞的感染情况  93-94
      2.2 Real-time PCR 检测siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞Med19 基因转录的影响  94-96
    3 Western blot 检测siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞Med19 基因表达的影响  96-97
    4 siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞生长周期的影响  97-98
    5 MTT 法检测细胞的增殖抑制  98-99
    6 siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞侵袭、运动能力的影响  99-101
    7 细胞克隆形成试验  101-102
  第三节 讨论  102-105
第四章 RNAi 沉默Med19 基因对人肺癌移植瘤生长、转移影响的实验研究  105-118
  第一节 材料与方法  106-109
    1 主要材料与来源  106
    2 实验动物  106
    3 实验方法  106-109
      3.1 人肺癌A549 细胞的培养、慢病毒转染及裸鼠肺癌移植瘤模型的建立  106-107
      3.2 观察项目  107-109
  第二节 实验结果  109-114
    1 观察裸鼠移植瘤出瘤时间、大小、称重  109-110
    2 移植瘤组织HE 染色及荧光示踪  110-111
    3 移植瘤肺脏转移情况观察  111-112
    4 移植瘤肝脏转移情况观察  112-114
  第三节 讨论  114-118
第五章 结论  118-119
参考文献  119-134
攻读博士期间发表的论文  134-135
致谢  135-136
中文摘要  136-140
Abstract  140-145

相似论文

  1. 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
  2. 125I粒子植入对晚期肺癌治疗效果的临床研究,R734.2
  3. 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1和ORF7 shRNA重组慢病毒的构建与鉴定,S852.65
  4. β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
  5. 沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响,S828
  6. 5-Aza-dC对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响,R734.2
  7. 肺癌患者癌组织和血浆p16基因甲基化的检测及去甲基化肺癌细胞生物学行为和p16基因转录的研究,R734.2
  8. 联合检测血清TPS，CEA，CYFRA21-1，NSE在肺癌诊断中的临床价值,R734.2
  9. 非小细胞肺癌组织中金属硫蛋白及基质金属蛋白酶-2的表达及相关性研究,R734.2
  10. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  11. 非小细胞肺癌CVATS肺叶切除133例分析,R734.2
  12. 培美曲塞治疗晚期非小细胞肺癌疗效观察,R734.2
  13. 肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断及疗效判断中的临床意义,R734.2
  14. 解氏肺癌二号方对小鼠Lewis肺癌伴胸水治疗价值的研究,R734.2
  15. 2006～2010年某院肺癌病案中M8000/3编码者相关特征分析,R734.2
  16. 趋化因子受体CCR5在非小细胞肺癌中的表达及意义,R734.2
  17. 硅化合物SILA409对人小细胞肺癌GRP78表达及与VP-16耐药的研究,R734.2
  18. RNAi沉默TTF-1表达对肺癌A549细胞凋亡影响的实验研究,R734.2
  19. 顺铂对小鼠肺癌细胞中P-糖蛋白表达的影响,R734.2
  20. 非小细胞肺癌患者外周血Survivin mRNA联合CK19 mRNA检测的临床研究,R734.2
  21. 无血清培养联合顺铂富集人肺癌干细胞的体外基础研究,R734.2

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com