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神经鞘磷脂合成酶基因沉默对SMMC-7721细胞凋亡的影响（血清SM、CETP和PLTP对2型糖尿病形成的作用）

作　者: 陈广伟
导　师: 石渊渊
学　校: 河南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 神经鞘磷脂合成酶 SMMC-7721细胞 基因沉默 磷脂转移蛋白 胆固醇脂转移蛋白 细胞凋亡 Ⅱ型糖尿病
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


近年报道称ⅡTDM（Ⅱ Type Diabetes mellitus，ⅡTDM）与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）关系密切，炎症可能是二者之间共同的病理基础。已知神经鞘磷脂（sphingomyelin，SM）是AS的独立危险因子，推测神经鞘磷脂对ⅡTDM有一定的影响。又知神经酰胺（Ceramide，Cer）是调节细胞凋亡、增殖的重要信号分子，SM和Cer均是鞘脂代谢的重要化合物，神经鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）是催化底物卵磷脂（Phosphatidylcholine，PC）和Cer生成产物SM和甘油二酯（Diglyceride，DAG）的关键酶，且动脉粥样硬化和ⅡTDM患者均存在脂代谢紊乱。因此，本课题以SMMC-7721细胞为实验模型，研究神经鞘磷脂合成酶基因沉默后与细胞凋亡的关系，并检测ⅡTDM患者血清中SM、磷脂转移蛋白（phospholipid transferprotein，PLTP）及胆固醇酯转移蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）水平，探讨与ⅡTDM的关系。目的：观察神经鞘磷脂合成酶基因沉默后其酶活性水平及细胞凋亡作用，探讨血清SM、CETP和PLTP水平与ⅡTDM之间的关系，为ⅡTDM发生机制和临床治疗提供理论依据。方法：以人肝癌（SMMC-7721）细胞作为实验模型，用MTT法筛选肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导SMMC-7721细胞凋亡的剂量、采用RNA干扰技术使神经鞘磷脂合成酶基因沉默、用薄层层法检测神经鞘磷脂合成酶基因沉默后酶活性水平、AnnexinV-FITC/PI双染法和Hoechst33258/PI检测细胞凋亡情况、Western blot检测Caspase-8及Caspase-3蛋白表达的变化。根据2009年美国糖尿病协会确诊ⅡTDM，酶法检测ⅡTDM患者血清SM水平与血糖值和荧光分析法测定CETP及PLTP水平。结果：MTT显示不同浓度的TNF-α作用对SMMC-7721细胞均有凋亡作用，凋亡率与其浓度呈正相关（剂量依赖关系），经筛选后本实验以TNF-α的浓度为200ng·μL-1诱导凋亡、基因沉默后神经鞘磷脂合成酶活性水平降低、细胞凋亡率升高，与对照组相比有显著差异、Caspase-8及Caspase-3蛋白量表达增加。ⅡTDM患者血清SM、PLTP和CETP水平高于对照组（P＜0.05）。结论：1.神经鞘磷脂合成酶基因沉默后其酶活性水平下降、凋亡率升高；2.血清高水平神经鞘磷脂、磷脂转移蛋白和胆固醇脂转移蛋白对ⅡTDM的发生具有促进作用。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
1 引言  10-12
2 材料、仪器与方法  12-24
  2.1 仪器设备  12-13
  2.2 主要试剂  13-14
  2.3 常用试剂配制方法  14-18
  2.4 实验方法及操作步骤  18-20
    2.4.1 MTT 检测 TNF-α对 SMMC-7721 细胞增殖的变化  18-19
    2.4.2 SMS 酶活性测定  19-20
  2.5 Hoechst33258/PI 双染法观察活细胞状态  20
    2.5.1 细胞培养、RNA 干扰操作同上  20
    2.5.2 转染后 Hoechst/pI 双染  20
  2.6 Annexin V-FITC、PI 双染法检测细胞凋亡  20
    2.6.1 细胞培养、RNA 干扰操作同上  20
    2.6.2 流式细胞术  20
  2.7 Western blot 检测蛋白表达的变化  20-22
    2.7.1 细胞培养、RNA 干扰操作同上  20
    2.7.2 细胞蛋白的提取  20
    2.7.3 考马斯亮蓝 G250 测定细胞总蛋白  20-21
    2.7.4 蛋白质凝胶电泳  21-22
    2.7.5 蛋白质转印  22
    2.7.6 Western blot 检测 Caspase-8，Caspase-3 及β-actin 蛋白量  22
  2.8 血清测定  22-23
    2.8.1 患者血清来源  22-23
    2.8.2 血清 SM、PLTP 和 CETP 测定  23
      2.8.2.1 血糖检测  23
      2.8.2.2 SM 测定  23
      2.8.2.3 PLTP 测定  23
      2.8.2.4 CETP 测定  23
      2.8.2.5 PLTP 和 CETP 测定的标准品  23
  2.9 统计学处理  23-24
3 实验结果  24-30
  3.1 TNF-α对 SMMC-7721 细胞的抑制作用  24
  3.2 SMS 酶活性测定  24
  3.3 Hoechst 33258/PI 联合染色 SMMC-7721 活细胞观察  24-25
  3.4 FITC-annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测结果  25
  3.5 Western-blot 检测蛋白表达量变化  25
  3.6 患者血清 SM、PLTP 及 CETP 等测定结果  25-30
4 讨论  30-34
5 参考文献  34-38
6 结论  38-40
7 附图及图版说明  40-44
文献综述  44-56
  1. 前言  44-45
  2. AS 的临床分期  45-46
    2.1 无症状隐匿期  45
    2.2 缺血期  45
    2.3 坏死期  45-46
    2.4 纤维化期  46
  3. ⅡTDM 发病病因的理论分析  46-47
    3.1 与 I 型ⅡTDM 有关的因素  46
    3.2 与ⅡTDM 有关的因素  46-47
    3.3 与妊娠型ⅡTDM 相关的因素  47
  4. SM、SMS 的概述  47-48
  5. AS 与ⅡTDM 的关系  48
  6. PLTP 在 AS 形成及ⅡTDM 中的作用  48-49
  7. CETP 与 AS 的形成的关系  49-50
  8. 总结和展望  50-52
  参考文献  52-56
附录A 缩略语词汇表  56-57
附录B 攻读学位期间发表的论文  57-58
致谢  58-59

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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