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鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位的串联表达及间接ELISA方法的建立

作　者: 孙罗美
导　师: 黄勇
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性支气管炎病毒 S1蛋白 表位串联 原核表达 间接ELISA方法
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病。由于IBV血清型众多,变异株和新的基因型不断出现,而不同血清型之间交叉保护力弱,给世界养禽业带来巨大经济损失。目前本病尚无特效疗法,建立快速、准确的IBV抗体检测方法对IB的防控具有重要意义。本研究利用DNAStar软件对GenBank上发表的IBV ZY3毒株S1蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出IBV S1蛋白上4段抗原表位区域,构建含柔性肽序列的串联基因,将串联基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法并对该方法的特异性、重复性和敏感性进行探索,为进一步组装成试剂盒奠定基础,也为IBV表位疫苗的研制奠定基础。1、利用生物信息学软件对四川流行毒株(ZY3毒株)S1蛋白进行分析,包括二级结构预测、抗原指数预测、蛋白质亲水性以及蛋白骨架柔韧性预测,同时利用MegAlign把H120、 H52、 QX、 M41、4/91、 SCYA、 SCNC、 SCDY和ZY3毒株的核苷酸序列进行比对,另外结合文献研究报道,筛选出ZY3毒株S1基因中相对保守且抗原性高的4段表位区域,即F1-F4(26-51AA、165-249AA、295-391AA及464-505AA)。为确保各片段形成各自的天然高级构象,独立发挥功能不至于相互干扰,不影响串联蛋白的生化特性,本试验以柔性肽G4S作为Linker将4个抗原表位基因依次串联成一条新基因F。并在串联基因的5’起始端引入起始密码子ATG,在3’端引入终止密码子TAA,以确保mRNA翻译时的有效终止。生物信息学软件分析表明该串联基因编码的蛋白有良好的抗原性、亲水性和柔韧性,该研究丰富了IBV S1蛋白的生物信息学资料,为IBV S1蛋白表位串联基因的原核表达以及间接ELISA方法的建立提供了基础材料。2、将构建成功的重组质粒用BamH I和XhoI双酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化入Ecoil BL21大肠杆菌,用IPTG诱导后,重组蛋白得到大量表达。利用超声波裂解法裂解菌体,经过SDS-PAGE分析,显示重组蛋白主要以包涵体的形式进行融合表达,其分子量大小约为42KD; Western-blot分析后,表明该融合重组蛋白能与鸡抗IBV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好的反应原性。通过对表达条件的优化,筛选出IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol／L,最佳诱导时间为4h,诱导温度为37℃。以纯化的重组蛋白为抗原包被酶标板,建立了以串联蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法。通过对一系列工作条件的优化知,抗原最佳包被浓度为12.5μg/mL,抗体最佳工作浓度为1：80,酶标二抗(HRP标记羊抗鸡IgG)最佳工作浓度为1：2000,判定阳性血清的标准为OD450nm大于0.363；通过实验知建立的ELISA方法也具有较强的敏感性和特异性,当阳性血清作1：500倍稀释时仍能判定为阳性,并且不与AIV(H5)、 AIV (H9)、 NDV、 IBDV标准阳性血清发生交叉反应。建立的ELISA方法显示了良好的应用前景,提供了一种快速、准确、简便的IBV抗体检测方法。本试验旨在探讨IBV串联基因F编码的蛋白的抗原性指数、亲水性、柔韧性以及其反应原性,并对其在ELISA检测方面的应用作了积极有益的探索,为其大规模、商品化应用奠定了基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩略表  8-10
目录  10-14
第一部分 文献综述及选题目的意义  14-28
  1 前言  14
  2 病原学  14-19
    2.1 分类地位  14
    2.2 病毒粒子结构  14-15
    2.3 基因组结构  15-16
    2.4 主要结构蛋白及其生物学功能  16-19
      2.4.1 纤突蛋白(S蛋白)  16-17
      2.4.2 核衣壳蛋白(N蛋白)  17-18
      2.4.3 膜蛋白(M蛋白)  18
      2.4.4 小膜蛋白(E蛋白)  18
      2.4.5 非结构蛋白  18-19
  3 传染性支气管炎流行病学的研究进展  19-24
    3.1 分子变异机制  19-20
    3.2 国外流行情况  20-22
    3.3 国内流行情况  22-24
  4 IBV抗体检测方法的研究进展  24-26
    4.1 血凝抑制试验(HI)  24
    4.2 病毒中和试验(VNT)  24-25
    4.3 琼脂扩散试验(AGP)  25
    4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)  25-26
  5 表位串联技术的研究进展  26
  6 研究的目的及意义  26-28
第二部分 试验研究  28-60
  第一章 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位的筛选及串联基因的克隆  28-42
    1 材料  28-30
      1.1 菌株与载体  28
      1.2 主要试验仪器  28-29
      1.3 试验试剂  29-30
        1.3.1 主要试剂  29
        1.3.2 常用试剂的配制  29-30
    2 实验方法  30-35
      2.1 IBV S1蛋白生物信息学分析及表位区域的确定  30
      2.2 引物设计  30
      2.3 IBV总RNA的提取  30-31
      2.4 串联基因F的拼接  31-34
        2.4.1 各表位的PCR扩增  32
        2.4.2 扩增产物的克隆  32-34
        2.4.3 各段表位的连接  34
      2.5 串联基因F的生物信息学分析  34-35
    3 实验结果  35-39
      3.1 IBV S1蛋白生物信息学分析结果  35
      3.2 IBV S1蛋白抗原表位的确定  35-36
      3.3 IBV S1蛋白各段表位的PCR扩增结果  36
      3.4 IBV S1蛋白各段表位双酶切鉴定  36-38
      3.5 表位串联基因F的鉴定  38
      3.6 表位串联基因F的结构特征分析  38-39
    4 讨论  39-41
      4.1 选择IBV S1蛋白作为研究对象的依据  39
      4.2 IBV S1蛋白抗原表位的分析及选择  39-40
      4.3 IBV S1蛋白各抗原表位的连接  40-41
      4.4 IBV S1蛋白串联基因F的构建策略  41
      4.5 表位串联基因F的生物信息学特征  41
    5 小结  41-42
  第二章 串联基因F的原核表达以及间接ELISA方法的初步建立  42-60
    1 材料  42-45
      1.1 试验材料  42
      1.2 主要仪器  42-43
      1.3 试验试剂  43-45
        1.3.1 主要试剂  43
        1.3.2 主要试剂的配制  43-45
    2 方法  45-50
      2.1 串联基因F的原核表达重组质粒的构建  45-46
        2.1.1 重组质粒的抽提与BL21(DE3)感受态细胞的制备  45
        2.1.2 重组质粒pMD19-T-F与pET-32a(+)载体的酶切回收  45
        2.1.3 连接、转化及鉴定  45-46
      2.2 重组蛋白的表达及纯化  46-48
        2.2.1 重组质粒pET32-F的表达  46
        2.2.2 SDS-PAGE鉴定  46
        2.2.3 表达条件的优化  46-47
        2.2.4 表达产物的初步纯化  47
        2.2.5 Western-blot分析  47-48
      2.3 IBV表位串联蛋白间接ELISA方法的建立  48-50
        2.3.1 重组蛋白最佳包被浓度及血清稀释度的确定  48-49
        2.3.2 血清最佳作用时间的确定  49
        2.3.3 酶标抗体最佳工作浓度的确定  49
        2.3.4 酶标抗体作用时间的确定  49
        2.3.5 封闭条件的确定  49
        2.3.6 底物显色时间的确定  49-50
        2.3.7 临界值的确定  50
        2.3.8 重复性试验  50
        2.3.9 敏感性试验  50
        2.3.10 特异性试验  50
    3 结果  50-58
      3.1 重组质粒的诱导表达  50-53
        3.1.1 IPTG最佳诱导浓度的确定  50-51
        3.1.2 最佳诱导时间的确定  51-52
        3.1.3 表达产物的可溶性分析  52
        3.1.4 Western-blot分析  52-53
      3.2 IBV S1蛋白串联基因间接ELISA方法的建立  53-58
        3.2.1 抗原最佳包被浓度及血清稀释度的确定  53-54
        3.2.2 血清最佳作用时间的确定  54
        3.2.3 酶标抗体最佳工作浓度的确定  54-55
        3.2.4 酶标抗体作用时间的确定  55
        3.2.5 封闭条件的确定  55
        3.2.6 底物显色时间的确定  55-56
        3.2.7 临界值的确定  56
        3.2.8 重复性试验  56-57
        3.2.9 敏感性试验  57-58
        3.2.10 特异性试验  58
    4 讨论  58-60
      4.1 表达载体pET-32a(+)和表达系统的选择  58-59
      4.2 重组质粒表达条件的优化  59
      4.3 ELISA检测方法的建立  59-60
    5 小结  60
结论  60-61
参考文献  61-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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