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草鱼NCCRP-1和IL-10基因的克隆和表达

作　者: 代礼平
导　师: 简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 草鱼 NCCRP-1基因 IL-10基因 原核表达 免疫组织化学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为研究对象,对其NCCRP-1和IL-10基因进行克隆、表达。通过提取草鱼头肾总RNA,应用同源性克隆和RACE-PCR方法获得NCCRP-1和IL-10基因全长cDNA序列,并对其进行原核表达分析。草鱼NCCRP-1基因cDNA全长为900 bp,完整开放阅读框(ORF)为714bp,编码237个氨基酸,5’非编码区为3 bp,3’非编码区为183 bp。草鱼NCCRP-1基因与鲤鱼(Cyprinus carpio L.)的同源性较高,为88%；与哺乳动物的同源性较低。构建了NCCRP-1和pET-32a载体的重组表达质粒,重组蛋白主要以包涵体形式存在；通过HisTrap HP柱子纯化重组蛋白,Western blot分析表明成功表达出目的蛋白,NCCRP-1重组蛋白分子量为47.8 kDa。制备了兔抗NCCRP-1表达蛋白血清,ELISA测定其效价为1：40000；用免疫组织化学方法检测到NCCRP-1在头肾和脾脏组织细胞中主要分布在胞浆内。草鱼IL-10基因cDNA全长为1365 bp,完整开放阅读框(ORF)为540 bp,编码179个氨基酸,5’非编码区为274 bp,3’非编码区为501 bp；草鱼IL-10基因与鲢鱼(Hypophthal michthys molitrix)的同源性较高,为99%；与哺乳动物的同源性较低。构建了IL-10和pET-32a载体的重组表达质粒,重组蛋白主要以包涵体形式存在；通过HisTrap HP柱子纯化重组蛋白,Western blot分析表明成功表达出目的蛋白,IL-10重组蛋白分子量为41.5 kDa。制备了兔抗IL-10表达蛋白血清,ELISA测定其效价为1：40000；用免疫组织化学方法检测到IL-10在头肾和脾脏组织细胞中主要分布在胞浆内。本研究为草鱼疾病防治提供了二定的理论依据,丰富和发展了鱼类分子免疫学的研究内容,为进一步研究NCCRP-1和IL-10蛋白的生物学特性以及在鱼类先天性免疫中的功能等研究奠定了基础。

全文目录


英文缩略语注释  6-7摘要  7-8Abstract  8-121 前言  12-21  1.1 鱼类非特异性免疫因子的研究进展  12-18    1.1.1 补体(complement)  12    1.1.2 趋化因子(Chemokine)  12-13    1.1.3 C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)  13-14    1.1.4 抗菌肽(Antimicrobial peptides)  14    1.1.5 干扰素(interferon,IFN)  14-15    1.1.6 转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)  15    1.1.7 转铁蛋白(transferrin,Tf)  15-16    1.1.8 凝集素(Lectin)  16    1.1.9 溶菌酶(Lysozyme)  16-17    1.1.10 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)  17    1.1.11 主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)  17-18  1.2 鱼类NCCRP-1的研究进展  18  1.3 鱼类IL-10的研究进展  18-19  1.4 本实验的研究目的、意义  19-212 草鱼NCCRP-1的克隆与表达分析  21-54  2.1 引言  21  2.2 实验材料  21-26    2.2.1 主要仪器设备  21-22    2.2.2 主要试剂及试剂盒  22-23    2.2.3 所用溶液及培养基的配制方法  23-25    2.2.4 实验动物  25    2.2.5 质粒载体、病毒及受体菌株  25    2.2.6 主要溶液及器皿的预处理  25-26  2.3 实验方法  26-41    2.3.1 总RNA提取  26    2.3.2 NCCRP-1的RACE克隆  26-32    2.3.3 生物信息学分析  32    2.3.4 NCCRP-1的原核表达  32-39    2.3.5 兔抗NCCRP-1多克隆抗体的制备  39-40    2.3.6 免疫组织化学分析  40-41  2.4 实验结果  41-52    2.4.1 NCCRP-1基因全长cDNA序列的克隆  41    2.4.2 NCCRP-1基因序列特征分析  41-44    2.4.3 关于NCCRP-1基因的分子系统学分析  44-45    2.4.4 NCCRP-1重组表达载体的构建  45-46    2.4.5 NCCRP-1基因的原核表达  46-47    2.4.6 融合蛋白NCCRP-1在大肠杆菌中表达条件的优化  47-49    2.4.7 重组蛋白的纯化及定量  49-50    2.4.8 兔抗NCCRP-1多克隆抗体效价测定  50    2.4.9 融合蛋白的免疫反应性  50-51    2.4.10 免疫组化分析  51-52  2.5 讨论  52-543 草鱼IL-10的克隆与表达分析  54-71  3.1 引言  54  3.2 实验材料  54  3.3 实验方法  54-58    3.3.1 总RNA提取  54    3.3.2 IL-10的基因克隆  54-56    3.3.3 生物信息学分析  56    3.3.4 IL-10的原核表达  56-58    3.3.5 兔抗IL-10多克隆抗体的制备  58    3.3.6 免疫组织化学分析  58  3.4 实验结果  58-69    3.4.1 IL-10基因全长cDNA序列的克隆  58    3.4.2 IL-10基因序列特征分析  58-60    3.4.3 基于IL-10基因的分子系统学分析  60-61    3.4.4 IL-10基因重组表达载体的构建  61-62    3.4.5 IL-10基因的原核表达  62-63    3.4.6 融合蛋白IL-10在大肠杆菌中表达条件的优化  63-66    3.4.7 重组蛋白的纯化及定量  66-67    3.4.8 兔抗IL-10多克隆抗体效价测定  67    3.4.9 融合蛋白的免疫反应性  67-68    3.4.10 免疫组化分析  68-69  3.5 讨论  69-714 总结  71-725 参考文献  72-83致谢  83-84作者简历  84-85导师简介  85

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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