学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鲤鱼肠道sglt1的表达与抗体制备

作　者: 侯彩霞
导　师: 聂国兴
学　校: 河南师范大学
专　业: 水产养殖
关键词: 鲤鱼 钠葡萄糖共转运载体1 原核表达 ELISA Sglt1抗体 抗体效价 免疫组织化学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


以鲤鱼(Cyprinus carpio)为研究对象,采用RT-PCR、SDS-PAGE电泳、ELISA等分子生物学及免疫学技术,对鲤鱼肠道钠/葡萄糖共转运载体1(sglt1)基因的克隆、表达及Sglt1抗体制备进行了研究。克隆了sglt1全长cDNA;表达了由sglt1基因编码、长度为92个氨基酸且具有一个抗原决定簇的多肽;以纯化的多肽为抗原,通过免疫新西兰长耳兔,成功获得了具有较高效价的Sglt1抗体。1、具有抗原决定簇多肽的表达。从鲤鱼肠道中克隆了sglt1基因编码区全长序列,选用pET-32a(+) Vector作为表达载体,设计限制性酶切位点EcoR I和Hind III,将编码92个氨基酸、具有Sglt1抗原决定簇的核苷酸片段连接至pET-32a(+)上,经筛选获得阳性重组子pET-32a(+)-sglt1(抗原决定簇片段);将阳性重组子转化至E.coli Rosetta中,获得重组因工程菌。通过IPTG诱导表达,获得目标多肽。SDS-PAGE电泳分析表明,目标多肽分子量约为30kDa。2、Sglt1抗体制备。以获得的多肽为抗原,与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混合,采用耳缘静脉结合皮下注射,免疫新西兰长耳兔4次,免疫总时长为38d。成功制备了鲤鱼Sglt1抗体,ELISA测得效价为1:105。通过免疫组织化学,验证了抗体的使用效果。结果表明,本研究制备的抗体可以成功应用于鲤鱼Sglt1的表达定位研究。本研究制备的Sglt1多克隆抗体是重要的研究工具,为鲤鱼肠道Sglt1表达及转运活性的系统研究奠定了基础。同时,获取的Sglt1多克隆抗体亦可用于其它鱼类Sglt1转运蛋白表达定位和表达定量研究。

全文目录


摘要  4-5ABSTRACT  5-7缩略语中英文对照  7-11第一章 引言  11-17  1.1 研究背景与意义  11  1.2 葡萄糖转运系统  11-17    1.2.1 Sglt1 的研究现状  11-12    1.2.2 Sglt1 的分子结构  12-13    1.2.3 Sglt1 的转运机制  13-14    1.2.4 鱼类sglt1 的研究  14-17第二章 鲤鱼肠道sglt1 的克隆与表达  17-37  2.1 材料  17-19    2.1.1 载体和菌种  17    2.1.2 实验动物与饲养管理  17    2.1.3 主要试剂  17-18    2.1.4 主要仪器  18    2.1.5 培养基  18-19  2.2 方法  19-29    2.2.1 组织取样及总RNA 提取  19    2.2.2 第一链cDNA 合成  19-20    2.2.3 sglt1 基因的克隆与序列分析  20-23    2.2.4 基因工程菌的构建  23-27    2.2.5 Sglt1 在E.coli Rosetta 中的诱导表达  27-28    2.2.6 Sglt1 蛋白SDS-PAGE 电泳分析  28-29    2.2.7 构建表达目标多肽的基因工程菌  29  2.3 实验结果  29-34    2.3.1 Total RNA 的质量检测  29-30    2.3.2 sglt1 基因的克隆和序列分析  30-31    2.3.3 原核表达载体的构建  31-33    2.3.4 重组蛋白的诱导表达  33-34  2.4 讨论  34-37    2.4.1 sglt1 基因的克隆  34-35    2.4.2 基因工程菌的构建  35-36    2.4.3 Sglt1 的原核表达  36-37第三章 鲤鱼肠道Sglt1 抗血清的制备  37-43  3.1 材料  37-38    3.1.1 质粒和菌种  37    3.1.2 实验动物与饲养管理  37    3.1.3 主要试剂和酶  37-38    3.1.4 主要仪器  38  3.2 方法  38-40    3.2.1 SDS-PAGE 电泳  38-39    3.2.2 Sglt1-His 融合蛋白浓度的测定  39    3.2.3 免疫新西兰长耳兔  39-40    3.2.4 颈动脉取血  40  3.3 结果  40-41    3.3.1 免疫结果  40-41    3.3.2 Sglt1 抗血清效价测定结果  41    3.3.3 颈动脉采血结果  41  3.4 讨论  41-43第四章 Sglt1 抗体的免疫组化检测  43-49  4.1 材料  43-44    4.1.1 主要用具  43    4.1.2 主要试剂配制  43-44    4.1.3 主要仪器  44  4.2 方法  44-46    4.2.1 组织取样  44    4.2.2 肠段石蜡包埋块的制备  44-45    4.2.3 免疫组化染色  45-46  4.3 结果  46-48    4.3.1 一抗工作浓度的确定  46    4.3.2 Sglt1 的应用效果  46-48  4.4 讨论  48-49小结  49-51参考文献  51-57致谢  57-59攻读学位期间学术业绩  59-60  一、发表的学术论文  59  二、参加的科研项目  59-60

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 微纤维相关蛋白4在肝纤维化组织中的表达和外周血浓度与肝病理分级的相关性研究,R575.2
  6. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  7. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  8. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  9. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  10. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  11. 免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立,R373
  12. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  13. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  14. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  15. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  16. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  17. 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
  18. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  19. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  20. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  21. 丙草胺和乙草胺的酶联免疫吸附分析方法研究,S482.4

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
© 2012 www.xueweilunwen.com