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猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定

作　者: 杨巍
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 S1蛋白噬菌体筛选技术免疫学研究
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种猪的急性、高度接触性肠道传染病。自1978年报道以来在欧洲以及亚洲许多国家相继爆发,给养猪业带来巨大损失,因此对于PED的诊断以及疫苗的研究就显得尤为重要。PEDV纤突糖蛋白(S)是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,又拥有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性。利用生物学软件对PEDV S基因进行了抗原位点分析,在不破坏线性抗原位点的前提下将S基因进行分割获得S基因的片段命名为S1。本试验在高效表达PEDV S1蛋白后,利用噬菌体展示技术筛选并鉴定了能与PEDV S1蛋白相互作用的多肽分子,为进行PED的快速诊断以及开发有效的新型疫苗奠定了基础。本试验成功构建了编码PEDV S1蛋白的pET30a-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行原核表达。将制备并纯化的重组蛋白进行复性和活性检测,结果表明这种融合蛋白具有一定的生物学活性。以重组蛋白为免疫原免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体。免疫荧光实验以及病毒抑制实验证明此多克隆抗体具有良好的生物学活性。利用噬菌体随机十二肽库,以PEDV S1重组蛋白为靶分子,对其进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物随机淘选出的10个噬菌体单克隆的核苷酸序列进行测定,并进行多肽序列的推导,结果表明,经过对靶分子的四轮筛选后,最终筛选出三个具有高度同源性的多肽,序列分别是MPAVMSSAQVPR,NLSNRLNLSPGI,YVIHQPYAMALR。ELISA方法对合成多肽的检测结果表明这三条多肽均能与重组的PEDV S1蛋白结合。病毒体外抑制实验表明所筛选出来的其中两条多肽M和N具有良好的生物活性。体内实验通过免疫昆明鼠检测了多肽的抗病毒活性,结果表明多肽M、N在小鼠体内起到了一定的中和病毒的作用。本实验为建立新的PED诊断方法以及新型多肽疫苗的开发提供了一定的理论基础和实验依据。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-10
1 引言  10-25
  1.1 猪流行性腹泻研究进展  10-18
    1.1.1 猪流行性腹泻的历史背景  10
    1.1.2 猪流行性腹泻病毒  10-15
    1.1.3 猪流行性腹泻的流行病学  15
    1.1.4 猪流行性腹泻的临床症状和病理变化  15-16
    1.1.5 猪流行性腹泻诊断方法  16-18
  1.2 PEDV S 蛋白研究进展  18-19
  1.3 噬菌体展示技术的研究进展  19-24
    1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理  19-20
    1.3.2 噬菌体展示系统的类型  20-22
    1.3.3 噬菌体展示技术的应用  22-24
  1.4 研究的目的与意义  24-25
2 材料与方法  25-41
  2.1 实验材料  25-28
    2.1.1 实验动物  25
    2.1.2 菌种、载体及质粒  25
    2.1.3 工具酶、试剂盒和抗体试剂  25
    2.1.4 标准参照物  25
    2.1.5 实验试剂的配制  25-27
    2.1.6 仪器设备  27-28
  2.2 实验方法  28-40
    2.2.1 原核表达载体的构建  28-31
    2.2.2 重组质粒在大肠杆菌表达系统中的诱导表达  31-32
    2.2.3 重组蛋白的纯化、复性及活性鉴定  32-33
    2.2.4 多克隆抗血清的制备  33-34
    2.2.5 多克隆抗血清的鉴定及生物活性的检测  34-35
    2.2.6 噬菌体随机十二肽库对靶分子亲和配体的生物淘选  35-37
    2.2.7 结合克隆的特征鉴定  37-39
    2.2.8 所选多肽配体共有氨基酸序列的推导及合成  39-40
    2.2.9 所选多肽的生物活性鉴定  40
    2.2.10 噬菌体体内抗病毒活性  40
  2.3 数据处理  40-41
3 结果  41-51
  3.1 原核表达载体pET30a-S1 的构建  41-42
    3.1.1 S1 基因的亚克隆  41
    3.1.2 重组表达质粒的PCR 鉴定和限制性酶切鉴定  41-42
  3.2 重组蛋白的表达及活性鉴定  42-44
    3.2.1 重组蛋白的表达  42
    3.2.2 重组蛋白的纯化  42-43
    3.2.3 重组蛋白的活性鉴定  43-44
  3.3 S1 多克隆抗血清的制备及活性鉴定  44-46
    3.3.1 多克隆抗血清效价的测定  44
    3.3.2 多克隆抗血清的免疫荧光实验结果  44-45
    3.3.3 多克隆抗血清的病毒抑制试验结果  45-46
  3.4 噬菌体十二肽库对S1 重组蛋白亲和配体的生物淘选  46-51
    3.4.1 噬菌体十二肽库对靶分子的四轮淘洗结果  46-48
    3.4.2 所选多肽的生物活性检测结果  48-49
    3.4.3 小鼠外周血液抗PEDV IgG 抗体含量动态变化  49
    3.4.4 小鼠外周血液抗S1 蛋白IgG 抗体含量动态变化  49-51
4 讨论  51-55
  4.1 S1 基因在大肠杆菌中的表达  51
  4.2 S1 基因原核载体表达质粒的设计与构建  51
  4.3 S1 基因的原核表达及表达条件的优化  51-52
  4.4 重组蛋白的纯化与活性鉴定  52-53
  4.5 多克隆抗血清的制备及活性鉴定  53
  4.6 S1 蛋白亲和肽的筛选与鉴定  53-54
  4.7 噬菌体体内免疫试验  54-55
5 结论  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-66
附录  66-68
攻读硕士学位期间发表的学术论文  68

猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定

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