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脂联素基因去信号肽区原核表达及酶免检测方法研究

作　者: 孙强
导　师: 王云龙
学　校: 河南师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 人脂联素去信号肽区 原核表达 标准品 酶联免疫
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 4次
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内容摘要


近年来,肥胖症、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化发病率不断升高,血浆中脂联素（adiponectin,ADPN）的含量与这类疾病的发生呈负相关,通过检测人血浆中脂联素的含量可反应这类疾病的发生状况。本研究通过基因工程获得了人脂联素去信号肽区域重组蛋白,并以此制备标准品,初步建立了人脂联素ELISA定量检测方法。根据NCBI上公布的人脂联素基因序列NM004797.2,利用primer5.0设计一对引物。从人脂肪组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得678bp的人脂联素去信号肽区的基因片段,将目的片段和载体pET-41a分别进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳,回收纯化目的片段和载体并进行连接,将连接产物转入DH5α,涂布LB固体培养基,挑取单菌落,扩大培养后用碱裂解法提取质粒,将双酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为pET-41a/ΔSADPN。将该重组质粒转入E.coli BL21（DE）3中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE表明重组蛋白以可溶性形式表达,并具有较好的免疫反应性。通过诱导表达条件的优化,确立了最佳的诱导条件为:25℃,IPTG浓度0.03mmol/L,诱导时间8h。融合蛋白含有组氨酸标签,用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,得到的融合蛋白溶液,经检测其浓度为2.1 mg/mL,纯化后的蛋白制备成标准品。以抗人脂联素单克隆抗体作为包被抗体,采用改良的过碘酸钠法,对人脂联素多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,作为标记抗体。棋盘滴定法确立人脂联素单克隆抗体的最佳包被浓度为1.0μg/mL;酶标抗体的最佳稀释倍数为1:4000;以脂联素去信号肽区重组蛋白为标准品绘制出的标准曲线,线性范围为1ng～30ng;与同类试剂盒进行临床试验比较,其检测结果通过t检验,P>0.05,没有显著性差异。本研究通过基因工程方法得到了免疫反应性较好的重组人脂联素去信号肽蛋白,制备了检测脂联素的标准品,初步建立人脂联素双抗体夹心检测方法,为进一步研制人脂联素ELISA定量检测试剂盒奠定基础。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
符号与缩略语  10-12
第一章 前言  12-22
  1.1 脂联素概述  12-17
    1.1.1 脂联素的发现  12-13
    1.1.2 脂联素的结构特点  13-14
    1.1.3 脂联素受体  14-15
    1.1.4 脂联素的信号转导通路  15-17
  1.2 脂联素与疾病  17-19
    1.2.1 脂联素与肥胖（obesity）  17-18
    1.2.2 脂联素与冠心病(coronary heart disease，CHD)  18
    1.2.3 脂联素与Ⅱ型糖尿病（type Ⅱ Diabetes Mellitus）  18-19
  1.3 脂联素检测方法的选择  19-20
  1.4 研究意义  20-22
第二章 材料与方法  22-44
  2.1 材料  22-32
    2.1.1 菌种  22
    2.1.2 载体  22-23
    2.1.3 组织、血清  23
    2.1.4 引物  23
    2.1.5 主要仪器与设备  23-24
    2.1.6 主要试剂  24-25
    2.1.7 主要溶液的配制  25-32
  2.2 方法  32-44
    2.2.1 人脂联素基因去信号肽区的克隆与鉴定  32-37
    2.2.2 重组ΔSADPN 蛋白的诱导表达及纯化  37-41
    2.2.3 双抗体夹心ELISA 检测方法的初步建立  41-44
第三章 结果  44-52
  3.1 人脂肪组织总RNA 的提取  44
  3.2 PCR 扩增目的基因  44
  3.3 重组质粒酶切鉴定  44-45
  3.4 重组菌 BL21(DE3)/pET41a(+)/ΔSADPN 诱导表达  45
  3.5 重组ΔSADPN 蛋白活性鉴定  45-46
  3.6 重组ΔSADPN 蛋白诱导表达条件的优化  46-47
  3.7 重组ΔSADPN 蛋白的纯化  47-48
  3.8 重组ΔSADPN 蛋白浓度的测定  48
  3.9 检测标准品的制备  48
  3.10 标准品稳定性试验  48-49
  3.11 包被抗体和检测抗体最佳浓度的选择  49
  3.12 检测标准曲线的绘制  49-50
  3.13 精密性试验  50
  3.14 方法对比试验  50-52
第四章 讨论  52-58
  4.1 表达载体的选择  52-54
  4.2 目的片段的选取  54-55
  4.3 可溶性表达条件的探索  55-56
  4.4 标准品的制备  56-57
  4.5 标准品的保存  57
  4.6 与血清标准品比较  57-58
第五章 结论  58-60
参考文献  60-66
附录 临床对比研究结果  66-68
致谢  68-70
攻读学位期间发表的学术论文目录  70-71

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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