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亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾细胞凋亡及CYP450酶系影响的研究

作　者: 朱文君
导　师: 李术
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 阿维菌素王鸽肝与肾氧化应激细胞凋亡细胞色素P450酶系
分类号: S856.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

阿维菌素（avermectin，AVM）为农畜两用杀虫剂，大环内酯类双糖化合物，具有良好的驱虫效果和安全性。随着AVM的广泛应用，环境中AVM的蓄积量越来越多，因此对生态系统造成了不良的影响。由于鸽子对环境中外源性物质的变化比较敏感，因此，被认为是监测生态环境污染的首选实验动物。本课题以王鸽肝脏和肾脏为研究对象，采用饲喂添加不同剂量AVM的日粮对照组饲喂不含AVM的正常日粮、低剂量组含量为20mg/（kg diet）、中剂量组40mg/（kg diet）、高剂量组60mg/（kg diet），复制王鸽亚慢性AVM中毒模型。分别在染毒后的第30d、60d、90d采样，通过对王鸽肝肾超微结构及病理组织学观察、抗氧化功能、蛋白质羰基（PCO）含量、DNA-蛋白质交联（DPC）率、微粒体细胞色素P450（CYP450）酶系的含量和活性、细胞凋亡及相关基因（caspase-3、caspase-8和fas）mRNA表达水平进行检测，探讨AVM对王鸽肝脏肾脏的毒性作用机理，为全面评价AVM对禽类的毒理学机制提供了科学依据。研究结果如下：1.通过HE染色、透射电镜法观察到不同剂量的AVM在不同时间点均能引起王鸽肝肾组织的结构改变，从形态学角度证明了AVM能够引起肝脏肾脏损伤。2.通过对抗氧化相关指标、PCO含量及DPC情况的检测，结果表明，AVM可引起谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）、PCO含量及DPC率升高，证实AVM能引起肝肾氧化损伤。3.采用TUNEL法对王鸽肝肾细胞凋亡进行检测并通过荧光实时定量PCR法检测caspase-3、caspase-8和fas mRNA表达水平，结果显示AVM能够诱发王鸽肝肾细胞凋亡并引起凋亡相关基因caspase-3、caspase-8和fas mRNA表达水平增加。4.通过对肝肾微粒体CYP450酶系的含量和活性的检测，显示AVM能够降低肝肾微粒体细胞色素P450（CYP450）和b5的含量，抑制NAPDH-细胞色素C还原酶（CR）、氨基比林-N-脱甲基酶（AND）、红霉素-N-脱甲基酶（ERND）和苯胺-4-羟化酶（AH）的活性，说明P450酶系与氧化应激共同参与AVM对肝肾的损伤过程。综上所述，AVM可干扰肝肾P450酶系的功能和氧化应激，导致形态结构改变，并能通过上调caspase-3、caspase-8和fas mRNA表达诱导肝肾细胞凋亡的发生，为进一步研究AVM对生物的影响提供理论依据，并为畜牧业发展和生态环境的保护提供了科学参考。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-13
1 引言  13-18
  1.1 阿维菌素的概述  13
  1.2 阿维菌素的毒性作用  13-14
  1.3 阿维菌素的损伤机制  14-17
    1.3.1 氧化应激  14-15
    1.3.2 细胞凋亡  15-16
    1.3.3 细胞色素 P450 氧化酶  16-17
  1.4 实验的目的与意义  17-18
2 材料与方法  18-27
  2.1 试验材料  18
    2.1.1 试验动物分组与处理  18
    2.1.2 样品采集与处理  18
  2.2 试验仪器  18-19
  2.3 试验试剂  19-20
  2.4 试验内容与方法  20-26
    2.4.1 临床症状观察  20
    2.4.2 病理组织学检查  20-21
    2.4.3 肝肾组织中抗氧化功能指标的检测  21
    2.4.4 肝肾组织中蛋白质羰基含量的检测  21-22
    2.4.5 肝肾组织中 DNA-蛋白质交联率的检测  22-23
    2.4.6 肝肾组织中细胞凋亡的检测  23
    2.4.7 肝肾组织中 caspase-3、caspase-8 和 fas 基因 mRNA 表达水平的荧光定量 PCR 检测法  23-26
    2.4.8 肝肾微粒体细胞色素 P450 酶系的测定  26
  2.5 试验数据的分析与统计  26-27
3 结果与分析  27-45
  3.1 临床表现  27
  3.2 阿维菌素诱导肝肾形态学变化检测结果  27-28
    3.2.1 HE 染色检测结果  27
    3.2.2 阿维菌素对肝肾超微结构影响的观察结果  27-28
  3.3 抗氧化功能相关指标的检测结果  28-31
    3.3.1 GSH-Px 活性的检测结果  28-29
    3.3.2 SOD 活性的检测结果  29-30
    3.3.3 MDA 含量的检测结果  30-31
  3.4 蛋白质碳基含量的检测结果  31-32
    3.4.1 肝组织蛋白质羰基含量的检测结果  31
    3.4.2 肾组织蛋白质羰基含量的检测结果  31-32
  3.5 DNA-蛋白质交联率的检测结果  32-33
    3.5.1 肝组织中 DNA-蛋白质交联（DPC）率的检测结果  32
    3.5.2 肾组织中 DNA-蛋白质交联（DPC）率的检测结果  32-33
  3.6 阿维菌素诱导肝肾细胞凋亡的检测结果（TUNEL 法）  33-34
    3.6.1 细胞凋亡的形态学变化  33
    3.6.2 细胞凋亡指数的检测结果  33-34
  3.7 荧光定量 PCR 检测 caspase-3、caspase-8 和 fas 基因 mRNA 表达水平  34-37
    3.7.1 荧光定量 PCR 检测方法的建立  34
    3.7.2 王鸽肝肾组织 caspase-3, caspase-8, fas 和β-actin 荧光定量 PCR 扩增结果  34-35
    3.7.3 肝组织 caspase-3 基因 mRNA 表达水平的检测结果  35
    3.7.4 肾组织 caspase-3 基因 mRNA 表达水平的检测结果  35
    3.7.5 肝组织 caspase-8 基因 mRNA 表达水平的检测结果  35-36
    3.7.6 肾组织 caspase-8 基因 mRNA 表达水平的检测结果  36
    3.7.7 肝组织 fas 基因 mRNA 表达水平的检测结果  36-37
    3.7.8 肾组织 fas 基因 mRNA 表达水平的检测结果  37
  3.8 肝肾微粒体细胞色素 P450 酶系活性及含量检测结果  37-45
    3.8.1 标准曲线绘制结果  37-38
    3.8.2 肝脏细胞色素 P450 含量检测结果  38-39
    3.8.3 肾脏细胞色素 P450 含量检测结果  39
    3.8.4 肝脏细胞色素 b5含量检测结果  39-40
    3.8.5 肾脏细胞色素 b5含量检测结果  40
    3.8.6 肝脏 NADPH-细胞色素 C 还原酶活性检测结果  40-41
    3.8.7 肾脏 NADPH-细胞色素 C 还原酶活性检测结果  41
    3.8.8 肝脏氨基吡啉-N-脱甲基酶活性检测结果  41-42
    3.8.9 肾脏氨基吡啉-N-脱甲基酶活性检测结果  42
    3.8.10 肝脏红霉素-N-脱甲基酶活性检测结果  42-43
    3.8.11 肾脏红霉素-N-脱甲基酶活性检测结果  43
    3.8.12 肝脏苯胺-4-羟化酶活性检测结果  43-44
    3.8.13 肾脏苯胺-4-羟化酶活性检测结果  44-45
4 讨论  45-50
  4.1 王鸽亚慢性阿维菌素中毒模型的建立  45
  4.2 亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾组织抗氧化功能的影响  45-46
  4.3 亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾组织蛋白质羰基含量的影响  46-47
  4.4 亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾组织 DNA-蛋白质交联率的影响  47-48
  4.5 亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾组织细胞凋亡及 caspase-3、caspase-8 和 fas mRNA 的影响  48-49
  4.6 亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾微粒体细胞色素 P450 酶系含量和活性的影响  49-50
5 结论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-59
附录  59-70
攻读学位期间发表的学术论文  70

亚慢性阿维菌素中毒对王鸽肝肾细胞凋亡及CYP450酶系影响的研究

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