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王鸽α-Syn基因克隆及AVM急性中毒对其在脑组织中表达的影响

作　者: 贾琳琳
导　师: 李术
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 王鸽脑组织 α-突触核蛋白阿维菌素免疫组化
分类号: S858.39
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一个由140个氨基酸残基构成的酸性蛋白,在脑组织中高度表达,主要聚集在神经元突触前末梢,在神经元的发育与形成、多巴胺合成、保持突触可塑性及突触囊泡的运输过程中发挥重要作用。相对于哺乳动物,禽类α-Syn的研究相对滞后,而关于王鸽α-Syn基因序列及其在王鸽脑内的分布还未见报道。本研究应用分子生物学技术克隆一段覆盖王鸽α-Syn完整编码区的序列;使用DNAMAN和DNAStar软件对人、黑猩猩、牛、猪、王鸽、原鸡、斑胸草雀及小鼠8种物种α-Syn cDNA编码区核苷酸和氨基酸序列进行比对,并构建生物进化树;利用基因工程技术在原核表达系统中表达了α-Syn并制备了多克隆抗体;应用免疫组化方法检测了王鸽脑组织中α-Syn的分布及阿维菌素(Avermectin,AVM)急性中毒对王鸽脑组织中α-Syn蛋白表达的影响,结果表明:1成功克隆了613 bp的王鸽α-Syn cDNA序列,其中包括ORF 432 bp,起始密码子ATG,终止密码子TGA,5′UTR区域16 bp,3′UTR区域165 bp,王鸽α-Syn由143个氨基酸残基组成,蛋白分子量为14.9 kDa。2王鸽与其他7个物种α-Syn编码区核苷酸序列同源性在81.71%~93.52%之间,与原鸡和斑胸草雀同源性最高均为93.52%,与黑猩猩的为83.80%,与人的为83.60%,与猪的为83.56%,与小鼠的为82.87%,与牛的为81.71%,王鸽与其他7种物种α-Syn氨基酸序列的同源性在83.22%~97.20%之间,说明不同物种间α-Syn基因高度保守,提示王鸽与其他已知物种α-Syn的功能相似。3在大肠杆菌表达系统中成功表达了pGEX6p-1-α-Syn融合蛋白,制备出兔抗王鸽α-Syn的多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体的效价为1:51 200,采用Western blot检测出多克隆抗体对于融合蛋白具有特异性。4王鸽海马、丘脑、嗅球、视叶、小脑5个部位中均检测到α-Syn,含量高低依次为海马、嗅球、丘脑、视叶和小脑,表明α-Syn在王鸽脑内分布广泛,并且分布具有差异性。5 AVM急性中毒后,王鸽海马、丘脑、嗅球、视叶和小脑5个部位中α-Syn蛋白表达均升高,海马、丘脑和嗅球的α-Syn表达与对照组相比差异显著(P<0.05),而视叶和小脑与对照组相比差异不显著(P>0.05),表明AVM急性中毒后,脑不同部位α-Syn表达量的升高具有差异性,提示AVM急性中毒引起的神经损伤与α-Syn表达增加有关。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-20
  1.1 α-Syn 的结构和功能  13-14
  1.2 α-Syn 与神经退行性疾病  14
  1.3 环境毒物对α-Syn 的影响  14-15
    1.3.1 农药对α-Syn 的影响  14-15
    1.3.2 金属离子对α-Syn 的影响  15
  1.4 α-Syn 的检测方法  15-16
  1.5 AVM 毒理学研究进展  16-18
  1.6 鸽子作为实验动物的意义  18
  1.7 本试验目的与意义  18-20
2 材料与方法  20-30
  2.1 主要试剂  20
    2.1.1 主要的菌株与载体  20
    2.1.2 主要试剂  20
  2.2 主要仪器  20-21
  2.3 实验动物及分组  21
    2.3.1 实验动物饲养与处理  21
    2.3.2 实验材料采集  21
  2.4 引物设计与合成  21-22
  2.5 王鸽α-Syn 基因序列的克隆  22-24
    2.5.1 脑组织中总RNA 的抽提  22
    2.5.2 总RNA 含量与纯度检测  22
    2.5.3 反转录反应  22-23
    2.5.4 王鸽α-Syn 基因PCR 扩增及鉴定  23
    2.5.5 王鸽α-Syn 基因PCR 产物的胶回收  23
    2.5.6 王鸽α-Syn 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析  23-24
    2.5.7 王鸽α-Syn 基因 3′-UTR 克隆  24
  2.6 王鸽α-Syn 基因重组表达载体的构建与鉴定  24-26
    2.6.1 王鸽α-Syn 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析  24-25
    2.6.2 王鸽α-Syn 原核表达载体的构建  25
    2.6.3 王鸽α-Syn 重组表达菌的诱导表达  25
    2.6.4 重组融合蛋白王鸽α-Syn 的SDS-PAGE 鉴定  25
    2.6.5 重组融合王鸽α-Syn 蛋白的纯化  25-26
  2.7 抗王鸽α-Syn 多克隆抗体的制备和鉴定  26-27
    2.7.1 抗原乳化  26
    2.7.2 动物接种  26
    2.7.3 抗血清的收集  26
    2.7.4 王鸽α-Syn 多克隆抗体效价测定  26-27
    2.7.5 王鸽α-Syn 多克隆抗体特异性的鉴定  27
  2.8 王鸽脑组织中α-Syn 含量的免疫组化检测  27-29
    2.8.1 载（盖）玻片的处理  27-28
    2.8.2 石蜡切片的制作  28
    2.8.3 PV 免疫组化二步法  28
    2.8.4 结果判定  28-29
  2.9 数据统计与分析  29-30
3 结果与分析  30-43
  3.1 王鸽α-Syn 基因克隆与测序结果  30-38
    3.1.1 王鸽脑组织中总RNA 的提取与鉴定  30
    3.1.2 王鸽α-Syn 基因的PCR 扩增结果  30-31
    3.1.3 王鸽α-Syn PCR 产物胶回收结果  31
    3.1.4 王鸽α-Syn 基因序列的测序结果  31-32
    3.1.5 王鸽α-Syn 基因编码区分析结果  32-36
    3.1.6 α-Syn 的3′RACE 反应结果  36-38
  3.2 重组表达载体的构建与鉴定  38-40
    3.2.1 目的片段与载体双酶切结果  38-39
    3.2.2 融合蛋白的表达、鉴定与纯化结果  39-40
  3.3 多克隆抗体的制备和鉴定结果  40-42
    3.3.1 间接ELISA 法测定多克隆抗体效价的结果  40-41
    3.3.2 Western blot 检测结果  41-42
  3.4 免疫组化方法检测α-Syn 基因在王鸽脑内的分布规律  42
    3.4.1 免疫组化方法优化选择  42
    3.4.2 α-Syn 在王鸽脑不同部位的表达  42
  3.5 王鸽AVM 急性中毒临床表现及α-Syn 在脑不同部位表达量的变化  42-43
4 讨论  43-49
  4.1 王鸽α-Syn 基因克隆  43-44
    4.1.1 王鸽α-Syn 基因编码区及同源性分析  43
    4.1.2 王鸽α-Syn 3′UTR 克隆  43-44
  4.2 重组王鸽α-Syn 蛋白表达条件优化  44-45
  4.3 王鸽α-Syn 多克隆抗体的制备  45
  4.4 α-Syn 在王鸽脑不同部位的分布  45-46
    4.4.1 免疫组化方法的建立和优化  45-46
    4.4.2 α-Syn 在王鸽脑中的分布  46
  4.5 AVM 急性中毒对 α-Syn 表达的影响  46-49
    4.5.1 AVM 急性中毒的临床表现  46-47
    4.5.2 AVM 急性中毒对 α-Syn 表达的影响  47-49
5 结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-57
附录  57-61
攻读硕士期间发表的学术论文  61

王鸽α-Syn基因克隆及AVM急性中毒对其在脑组织中表达的影响

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