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突变型Parkin与OGCP相互作用对HEK293细胞凋亡的影响及PD患者HtrA2/Omi基因的突变分析

作　者: 王春喻
导　师: 唐北沙
学　校: 中南大学
专　业: 神经病学
关键词: 帕金森病 Parkin OGCP 细胞凋亡 线粒体膜电位 HtrA2/Omi 限制性片段长度多态性 变性高效液相色谱 突变分析
分类号: R742.5
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一部分突变型Parkin与OGCP相互作用对HEK293细胞凋亡的影响Parkin基因是帕金森病的致病基因之一,Parkin蛋白作为一种E3连接酶,能够介导底物蛋白的泛素化过程。Parkin蛋白氨基端含有一个泛素样的(ubiquitin-like,Ub1)结构域,羧基末端是环指一环指间区一环指(Ring-IBR-Ring,RIR)结构域,由两个环指结构(Ring1,R1和Ring2,R2)及它们之间的环指间区(IBR)所组成。其RIR区主要是参与与E2泛素结合酶作用,而Ub1区则主要参与对底物的识别。R42P和T240R是parkin的两种常见的致病点突变,分别位于Ub1区和R1区。α-酮戊二酸载体蛋白(2-oxoglutaratecarrier protein,OGCP)位于线粒体上,能运输还原型谷胱甘肽进入线粒体内,清除线粒体内源性的氧自由基、增强细胞抗氧化能力。在前期工作中,已证实Parkin与OGCP相互作用,OGCP是parkin的泛素化底物蛋白。在本课题中我们对Parkin的两种突变体parkin(R42P)和parkin(T240R)与OGCP的相互作用进行研究,同时研究它们对HEK293细胞的影响。利用前期已经构建好的pcDNA3.1-myc-OGCP真核表达载体建立OGCP-myc稳定表达的HEK293细胞株,并通过Western blot、RT-PCR证明OGCP-myc稳定表达的HEK293细胞株已成功建立。应用免疫荧光和激光共聚焦显微镜共定位技术,结果发现在HEK2 93细胞中,Parkin(WT)-vsvg、Parkin(R42P)-vsvg和Parkin(T240R)-vsvg融合蛋白分别和OGCP-myc融合蛋白存在共定位;免疫共沉淀实验则证明Parkin(WT)-vsvg融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在相互作用,而Parkin(R42P)-vsvg融合蛋白和Parkin(T240R)-vsvg融合蛋白与OGCP-myc融合蛋白均不存在相互作用。通过Western blot,我们发现在HEK293细胞中,OGCP与野生型Parkin共转组的OGCP-myc表达量明显降低,其余三组OGCP-myc表达量无明显差别,表明野生型parkin能够促进OGCP的代谢,而突变型parkin对OGCP的代谢影响不明显。应用流式细胞技术,以荧光FITC为探针进行细胞凋亡检测,以Rhodamine123为探针进行线粒体膜电位的测定,以DCFH-DA为探针进行细胞内活性氧测定,结果发现,经100nmol/l鱼藤酮诱导的所有细胞组的细胞活力和线粒体膜电位明显低于未经鱼藤酮诱导的细胞组,而细胞内活性氧和细胞凋亡率则明显高于未经鱼藤酮诱导的细胞组;同时发现Parkin能够提高经鱼藤酮诱导凋亡的HEK293细胞的细胞活力和线粒体膜电位,降低细胞内活性氧,从而降低鱼藤酮诱导的细胞凋亡率,而Parkin突变(R42P和T240R)则降低HEK293细胞尤其是经鱼藤酮诱导的HEK293细胞的细胞活力和线粒体膜电位,增加细胞内活性氧,促进细胞凋亡;此外,还发现OGCP可以提高鱼藤酮诱导的HEK293细胞的细胞活力和线粒体膜电位,降低细胞内的活性氧,从而抵抗鱼藤酮诱导的细胞凋亡。而且,OGCP可以抑制由于Parkin突变(R42P和T240R)导致的细胞活力下降、线粒体膜电位降低和活性氧增加,从而减少Parkin突变(R42P和T240R)导致的细胞凋亡。第二部分帕金森病患者HtrA2/Omi基因的突变分析Strass等发现HtrA2/Omi错义突变G1195A和多态G421T与德国的散发PD有关,我们采用限制性片段长度多肽性(RestrictionFragment Length Polymorphism,RFLP)分析法对236例大于50岁的散发性帕金森病患者进行了上述位点的检测,结果未发现G1195A和G421T改变。为了进一步了解HtrA2基因与我国晚发型帕金森彩欠翊嬖谙喙匦?我们采用了变性高效液相色谱(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography,DHPLC)的方法和直接测序法对236例大于50岁的散发性帕金森病患者和200名正常健康者的HtrA2/Omi基因的8个外显子进行突变检测,结果仅在一名患者的一号外显子发现一个已知多态(rs2231249),未发现新的突变及多态。提示我国年龄大于50岁的PD患者发病可能与HtrA2/Omi基因无关。

全文目录


中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
英文缩略词表  12-14
前言  14-19
  1. 帕金森病概述  14
  2. Parkin、OGCP与帕金森病  14-17
  3. HtrA2/Omi基因与帕金森病  17-19
第一部分 突变型Parkin与OGCP相互作用对HEK293细胞凋亡的影响  19-74
  第一章 突变型Parkin与OGCP相互作用研究  19-48
    第一节 材料和方法  19-36
    第二节 结果  36-46
    第三节 讨论  46-48
  第二章 野生型Parkin、突变型Parkin与OGCP相互作用对HEK293细胞的细胞活力、细胞凋亡、细胞内活性氧和线粒体膜电位的影响  48-74
    第一节 材料和方法  48-54
    第二节 结果  54-70
    第三节 讨论  70-74
第二部分 帕金森病患者HtrA2/Omi基因的突变分析  74-100
  第一章 帕金森病患者HtrA2基因的A141S多态和G399S突变检测  74-83
    第一节 材料和方法  74-81
    第二节 结果  81-83
  第二章 帕金森病患者HtrA2/Omi基因突变分析  83-98
    第一节 材料和方法  83-92
    第二节 结果  92-98
  第三章 讨论  98-100
结论  100-101
参考文献  101-111
综述  111-128
致谢  128-129
攻读学位期间主要的研究成果  129

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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