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脐血间充质干细胞移植治疗帕金森大鼠的实验研究

作　者: 冯德朋
导　师: 李雪莉
学　校: 泰山医学院
专　业: 神经病学
关键词: 脐血间充质干细胞帕金森病移植
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:研究脑内移植脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）治疗帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）的可行性及可能的机制。方法:⑴帕金森大鼠模型建立:腹腔注射1%戊巴比妥麻醉,麻醉平稳后将大鼠固定于立体定向仪上,减开头部皮肤暴露前囟,以前囟为标准参考点,确定右侧黑质致密部（SNC）:前囟后4.4 mm,矢状缝右侧1.2 mm,硬膜下7.8 mm和中脑腹侧被盖（VTA）:前囟后4.8 mm,矢状缝右侧1.0 mm,硬膜下7.8 mm。每点注射4 g/L的6-羟基多巴5μL,注射速度1μL/min,注射完毕停针5min。2周后腹腔注射APO（0.25mg/kg）诱导其向健侧旋转,共筛选3周,每次记录30分钟,旋转210圈以上者为PD模型大鼠。⑵脐血间充质干细胞采集:无菌条件下采集脐血样本（每份60到120毫升。脐血采集来自聊城市人民医院妇科,并且经过伦理部门审核及家属知情签署知情同意书）。⑶干细胞传代分离:细胞接种于含15%的马血清和15%胎牛血清（FCS）的低糖DMEM中,放置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中培养,首次于5⁷天后半量换液传代,以后每2³天半量换液传代。培养后第三代分离用于移植。⑷脑内移植:移植靶点取纹状体内:①前囟前（AP）1.0mm,中线右（MR）3.0mm,硬脑膜下（DV）5.0mm;②AP 1.0mm,MR 3.4mm,DV 4.5mm。腹腔内注射1 %戊巴比妥（40mg/kg）麻醉大鼠,平稳后立体定向注射MSCs 1.0310⁶/只,每点注射5μl（1μl/min）,注射后停针10分钟,缓慢退针（1mm/分钟）,缝合切口。PBS对照组与MSCs移植组移植的靶点一致,注射同体积的PBS。⑸行为学检测:分别于术后每周进行旋转行为测试,大鼠的腹内注射阿朴吗啡0.5mg/kg,注射10分钟后开始观察,并记录大鼠的旋转行为共记录30分钟。⑹免疫组化:对照组PD大鼠及MSCs移植后2、4周的PD大鼠各2只,过量麻醉,开胸,经心脏从胸主动脉滴入200ml生理盐水,然后灌注4%多聚甲醛200ml进行内固定,断头取脑,浸泡于4%多聚甲醛24小时以上进行外固定,脱水、包埋、常规石蜡切片。片厚5-6μm,取纹状体和黑质部分行免疫组织化学染色显示。⑺统计学方法:所有资料应用SPSS17.0软件包处理,数据以均数±标准差表示,计量资料采用t检验,p<0.05有统计学意义。结果:1.移植后PD大鼠行为学检测阿朴吗啡诱导的大鼠旋转试验显示移植MSCs组PD大鼠转圈次数随着时间延长逐渐下降,而移植PBS的对照组PD大鼠转圈次数没有明显改变,且移植后3周至8周两组各时间点旋转圈数有明显差异（P < 0. 05）,具有统计学意义。2.脑组织免疫组织化学染色术后2周时,MSCs移植鼠纹状体针道内及附近TH阳性细胞存在;PBS注射对照组鼠的纹状体针道处无外源性细胞存在。术后2个月时,MSCs移植组鼠纹状体针道内仍有细胞存活,并有TH阳性细胞存在,PBS注射对照组鼠纹状体处无TH阳性细胞表达。3.实验大鼠的正常侧的黑质部分表达TH阳性细胞明显多于损伤侧。损伤侧2周时TH阳性细胞数比正常侧减少,两组无明显差异（P>0.05）。8周时MSCs移植组阳性表达细胞数多于PBS组,但无统计学意义（P>0.05）。4.实验动物脑内未发现畸胎瘤。结论:脑内移植脐血间充质干细胞后可存活并且分化形成TH蛋白,且帕金森模型大鼠行为学有明显改善,说明间充质干细胞移植治疗帕金森病的可行性。

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中文摘要 4-6ABSTRACT 6-9符号说明 9-11前言 11-14材料和方法 14-20结果 20-21讨论 21-32结论 32-33附表 33-34附图 34-36参考文献 36-44综述 44-52 参考文献 49-52致谢 52-53攻读硕士期间发表的学位论文目录 53

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