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DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用

作　者: 陈宗艳
导　师: 汪铭书；程安春
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭乙型肝炎病毒 preS基因 原核表达 侵染规律 HepG2.2.15细胞 抗病素治疗
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)与乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸(GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326),具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法(间接法);同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高(P＜0.01),乳酸脱氢酶活性升高(P＜0.01),肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物(代号PNA)的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组(50mg/kg)基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。

全文目录


本研究的创新点  10
中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
缩略词  17-18
第一部分 文献综述  18-61
  第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展  18-46
    1 DHBV生物学特性  18-34
      1.1 包膜蛋白  19-22
      1.2 核蛋白  22-26
      1.3 P蛋白  26-31
      1.4 X抗原  31-34
    2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型  34-36
      2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立  34-35
      2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用  35-36
    3 DHBV感染鸭动物模型  36-39
      3.1 DHBV感染动物模型的建立  36-37
      3.2 DHBV感染动物模型的影响因素  37-39
    4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用  39-44
      4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型  39-42
      4.2 DHBV突变株的生物学意义  42-43
      4.3 抗HBV药物筛选模型  43-44
      4.4 液制品消毒学领域的应用  44
    5 小结  44-46
      5.1 存在的问题  44-45
      5.2 展望  45-46
  第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展  46-61
    1 概述  46
    2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统  46-52
      2.1 原核表达系统  47-50
      2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达  50-51
      2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素  51-52
    3 病毒功能性基因的原核表达  52-57
      3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达  52-54
      3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达  54-57
    4 应用前景  57-61
      4.1 preS蛋白的功能研究  57-59
      4.2 preS抗原的诊断及预后作用  59
      4.3 preS抗原与疫苗  59-61
第二部分 实验研究  61-158
  第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析  61-84
    1 材料  61-63
      1.1 实验动物  61
      1.2 主要试剂  61
      1.3 菌株及质粒  61-62
      1.4 主要试剂配制  62
      1.5 主要仪器  62-63
    2 方法  63-68
      2.1 阳性血清的分离  63-65
      2.2 DHBV全基因组的克隆  65-68
    3 试验结果  68-78
      3.1 血清DHBV-DNA的分离  68-69
      3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆  69
      3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果  69-71
      3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析  71-78
    4 讨论  78-83
    5 小结  83-84
  第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达  84-102
    1 材料  84-86
      1.1 菌株及表达载体  84
      1.2 试验动物  84
      1.3 常用材料与试剂  84
      1.4 主要试剂配制  84-85
      1.5 仪器与设备  85-86
    2 方法  86-94
      2.1 扩增目的基因的引物设计  86
      2.2 PCR扩增目的基因  86-87
      2.3 PCR产物的鉴定  87
      2.4 原核表达质粒的构建  87-89
      2.5 转化表达菌株BL21  89
      2.6 诱导表达  89
      2.7 表达产物的SDS-PAGE分析  89-90
      2.8 Western blotting检测  90
      2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析  90-91
      2.10 表达条件的优化  91
      2.11 重组蛋白的大量诱导表达  91
      2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化  91-92
      2.13 纯化蛋白的应用  92-94
    3 结果  94-98
      3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳  94
      3.2 T载体克隆及测序鉴定  94
      3.3 原核表达质粒的构建及鉴定  94
      3.4 诱导表达  94-95
      3.5 可溶性分析  95
      3.6 免疫印迹  95
      3.7 表达条件的优化  95-96
      3.8 重组蛋白的纯化  96
      3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白  96-97
      3.10 纯化蛋白的应用  97-98
    4 讨论  98-101
    5 小结  101-102
  第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位  102-117
    1 材料  102-103
      1.1 试验毒株  102
      1.2 试验动物  102
      1.3 主要仪器  102-103
      1.4 主要试剂  103
      1.5 主要试剂配制  103
    2 方法  103-107
      2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制  103-104
      2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集  104
      2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立  104-107
    3 结果  107-111
      3.1 免疫组化方法的建立  107-109
      3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究  109-111
    4 讨论  111-116
      4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立  111-114
      4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义  114-115
      4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究  115-116
    5 小结  116-117
  第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立  117-125
    1 材料  117-118
      1.1 试验毒株  117
      1.2 主要仪器  117
      1.3 主要试剂  117-118
    2 方法  118-119
      2.1 标准品的制备  118
      2.2 待检标本的来源  118
      2.3 FQ-PCR条件的建立和优化  118-119
      2.4 FQ-PCR的敏感性检测  119
      2.5 FQ-PCR的特异性检测  119
      2.6 FQ-PCR的可重复性检测  119
    3 结果  119-121
      3.1 反应体系的优化  119
      3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立  119-120
      3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验  120
      3.4 荧光定量PCR特异性试验  120-121
      3.5 荧光定量PCR敏感性试验  121
    4 讨论  121-124
    5 结论  124-125
  第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律  125-141
    1 材料  125-126
      1.1 试验毒株  125
      1.2 试验动物  125
      1.3 主要仪器  125-126
      1.4 主要试剂  126
    2 方法  126-127
      2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制  126
      2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究  126
      2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律  126-127
      2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究  127
    3 结果  127-135
      3.1 病理组织学变化  127-128
      3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律  128-131
      3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律  131-132
      3.4 血液病理学变化  132-135
    4 讨论  135-140
      4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义  135-137
      4.2 DHBV感染发病机理探讨  137
      4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律  137-140
    5 小结  140-141
  第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究  141-158
    1 材料  141-142
      1.1 供试药物  141
      1.2 常用材料与试剂  141-142
      1.3 仪器与设备  142
      1.4 试剂配制  142
    2 体外实验方法  142-147
      2.1 细胞株  142-143
      2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养  143
      2.3 细胞毒性试验  143-144
      2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验  144-145
      2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测  145-146
      2.6 细胞总DNA的提取及定量检测  146-147
    3 体内实验方法  147-148
      3.1 毒株  147
      3.2 主要试剂  147
      3.3 实验动物及分组  147
      3.4 鸭肝组织标本形态学观察  147-148
    4 结果  148-155
      4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果  148
      4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果  148-150
      4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果  150-151
      4.4 病理学检查结果  151-155
    5 讨论  155-157
    6 小结  157-158
参考文献  158-176
致谢  176-177
攻博期间发表的论文  177

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