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ASGPR介导的靶向siRNA抑制HBV的复制与表达

作　者: 马婧薇
导　师: 沈关心
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 乙型肝炎病毒 RNA干扰 HepG2.2.15细胞 去唾液酸糖蛋白受体 基因靶向
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


【目的】设计与构建针对乙型肝炎病毒（HBV）基因的不同序列特异性siRNA载体，探讨各siRNA对HepG2.2.15细胞HBV复制和表达的作用。筛选获得具有高效沉默HBV的载体，以去唾液酸受体为靶点将其靶向HepG2.2.15细胞，观察靶向与沉默效应、以及对细胞活性的影响，为进一步体内靶向研究奠定基础。【方法】1.特异性siRNA真核载体的构建：设计并合成6对针对HBV基因的不同序列siRNA寡核苷酸，经退火形成双链，然后经T4连接酶连接，克隆入表达EGFP的真核载体，命名为pGenesil-siHBV1～6，并设立与HBV序列无关的pGenesil-siHBV-HK作为阴性对照。2.重组体的生物活性鉴定：将重组质粒pGenesil-siHBV1～6和pGenesilsiHBV-HK用脂质体分别转染HepG2.2.15细胞。采用实时荧光定量PCR检测转染后2d、3d、4d靶基因的mRNA和细胞培养上清中cccDNA的水平；ELISA检测转染后2d、3d、5d、7d细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达。3.去唾液酸受体的靶向作用：将具有高效沉默HBV的siRNA载体利用jetPEI-Hepatocyte靶向转染HepG2.2.15细胞，倒置相差荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测细胞内EGFP的表达，检测转染效率；FCM检测细胞内HBcAg的表达以及转染后3d细胞的凋亡；ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，细胞免疫化学酶标技术观察细胞内HBsAg的表达。【结果】1. HBV特异性siRNA载体的构建：PCR、酶切及测序鉴定结果表明，针对HBV基因特异性的siRNA真核载体构建成功。2. HBV特异性siRNA载体的生物活性：Realtime-PCR、ELISA分别从mRNA、蛋白质和cccDNA水平检测，结果表明pGenesil-siHBV1～6均可不同程度的抑制HBV的复制和抗原的表达，其中pGenesil-siHBV1的抑制效果最强。3. ASGPR靶向pGenesil-siHBV1对HBV的沉默效应：将pGenesil-siHBV1利用jetPEI-Hepatocyte靶向转染HepG2.2.15细胞，倒置相差荧光显微镜下可见绿色荧光，而无jetPEI-Hepatocyte转染对照组未见绿色荧光，FCM检测绿色荧光阳性细胞约为45％；FCM检测细胞内HBcAg的表达以及ELISA检测靶向实验组细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达低于LipofectamineTM2000转染对照组，且二者均显著低于无关序列对照组；细胞免疫化学酶标技术观察细胞内HBsAg的表达与无关序列对照组比较显著降低；FCM检测转染后3d的细胞凋亡无明显变化。【结论】结果表明针对HBV的不同siRNA的沉默效应存在差异；ASGPR介导的靶向递送siRNA载体能更好的发挥沉默HBV基因复制与表达的作用，为下一步的体内实验奠定了良好的基础。

全文目录


英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
材料  12-16
方法  16-26
结果  26-36
讨论  36-38
小结  38-39
参考文献  39-41
综述一  41-48
  参考文献  45-48
综述二  48-63
  参考文献  56-63
感言  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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