学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

虎源H_5N_1亚型流感病毒HA基因与NP基因核酸疫苗和重组腺病毒活载体疫苗的实验研究

作　者: 彭广能
导　师: 汪开毓；夏咸柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 虎 H5N1亚型流感病毒 核酸疫苗 重组活载体疫苗 免疫
分类号: S852.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 109次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


[目的]构建能够分别表达虎源H5N1亚型流感病毒血凝素(HA)基因和核蛋白(NP)基因的真核表达质粒以及表达HA和NP蛋白重组犬2型腺病毒(CAV-2)活载体疫苗(CAV-2-HA和CAV-2-NP),用所构建的真核表达质粒和活载体疫苗免疫小鼠,检测各质粒和活载体疫苗的免疫水平及其攻毒保护率,通过本实验为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗和重组活载体疫苗的应用研究提供理论与技术基础。[方法]利用设计合成的HA和NP引物,从A/Tiger/Harbin/132/2007 (H5N1)毒株的鸡胚尿囊增殖液中对该毒株的HA和NP基因进行PCR扩增、克隆和测序分析；应用常规分子生物学方法,构建能够分别表达H5N1亚型流感病毒HA和NP基因的真核表达质粒pVAX-HA和pVAX-NP以及同时表达猫IL-18基因和H5N1亚型流感病毒NP/HA基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP,应用间接免疫荧光和间接ELISA方法检测各真核表达质粒在乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21)中的表达情况。然后将含有NP/HA基因的表达盒(CMV+NP/HA+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处,分别获得含有NP/HA表达盒的穿梭载体pVAXΔE3-NP/HA。用SalⅠ+NruⅠ分别对pVAXΔE3-NP/HA和pPoly2-CAV2进行双酶切,将含有NP/HA表达盒的片段定向克隆入pPoly2-CAV2,获得在E3区缺失处插入NP/HA表达盒的重组质粒pCAV-2-NP/HA。释放CAV-2-NP/HA重组基因组,脂质体介导转染犬肾细胞(DK),获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的重组病毒(CAV-2-NP/HA)。从形态学、基因组水平、NP/HA基因的转录、NP/HA蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。用所构建的4种真核表达质粒和2种重组病毒分别进行小鼠免疫实验和攻毒保护实验。真核表达质粒的免疫实验共设pVAX-HA、pVAX-NP、pVAX-HA和pVAX-NP联合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合、PBS对照7个免疫组,每组11只小鼠,采用肌肉注射的方法,以15天的时间间隔免疫3次后15天,用间接ELISA方法检测各免疫组小鼠产生的抗AIV的抗体水平；用MTT法检测各免疫组小鼠产生的细胞免疫水平；用H5N1亚型流感病毒强毒株滴鼻攻毒,检测各免疫组的攻毒保护率。重组病毒的免疫实验共设CAV-2-HA、CAV-2-HA和CAV-2-NP联合免疫、CAV-2三组,每组13只小鼠。采用滴鼻(50μL)+皮下注射(250μL)的免疫方法,以14天的时间间隔共免疫接种2次。每次免疫后14天,每组各扑杀2只采血收集血清,剩下9只中3只用于攻毒后4天处死,测定攻毒后肺滴度,剩余6只用于检测攻毒后的保护率。[结果]成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007 (H5N1)毒株的HA和NP全基因,长度分别为1704bp和1479bp,分别编码568和493个氨基酸。成功构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的4种真核表达质粒(pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP)和2种重组病毒(CAV-2-HA和CAV-2-NP)。这4种真核表达质粒均能在BHK-21细胞中表达具有生物活性的HA和NP蛋白,均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫,各免疫组小鼠在受到超大剂量(10000 MLD50/只)的强毒攻击后,各组免疫保护率分别为：pVAX-HA组60%、pVAX-NP组20%、pVAX-HA和pVAX-NP联合组60%、pIRES2-IL-18-HA组20%、pIRES2-IL-18-NP组0%、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合组20%、PBS对照组0%。CAV-2-NP/HA具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2-NP/HA在繁殖的过程中没有对H5N1 NP/HA表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录H5N1 NP/HA的mRNA, ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP/HA单克隆抗体所识别,在体外具有良好的遗传稳定性。动物免疫实验表明CAV-2-HA、CAV-2-NP两种重组活载体疫苗均能诱导小鼠产生特异性的免疫反应,以CAV-2-HA效果最好,对小鼠的攻毒保护率为83.3%,CAV-2-HA和CAV-2-NP联合免疫的保护率为16.7%,对照组(CAV-2)为0%。[结论]本实验首次成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007毒株的HA和NP全基因；首次成功构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的4种核酸疫苗和2种重组犬2-型腺病毒活载体疫苗,它们均能诱导小鼠产生免疫保护作用,这为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗和重组活载体疫苗的应用研究奠定了理论与技术基础。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
符号说明  10-18
前言  18-21
第一篇 文献综述  21-60
  第一章 禽流感病原学及流行病学研究进展  21-42
    1 流感病毒概述  21-23
      1.1 流感病毒的分类  21-22
      1.2 流感病毒的形态与结构  22-23
    2 禽流感病毒病原学特点  23-35
      2.1 AIV的分类与命名  23-24
      2.2 AIV的理化特性  24
      2.3 AIV的基因组及其编码蛋白质  24-35
        2.3.1 血凝素基因及其编码的蛋白质  25-27
        2.3.2 NA基因及其编码的神经氨酸酶  27-28
        2.3.3 编码核衣壳蛋白基因及核蛋白  28-29
        2.3.4 M基因及编码的基质蛋白  29-30
        2.3.5 其他基因片段及编码蛋白  30-32
        2.3.6 AIV的复制分子机制与基因遗传变异性  32-35
    3 H5N1亚型禽流感流行现状  35-40
      3.1 H5N1禽流感在禽类中流行现状  35-37
      3.2 H5N1禽流感病毒在候鸟中的流行  37
      3.3 H5N1禽流感病毒对哺乳动物的感染  37-38
      3.4 H5N1禽流感病毒对人的感染  38-40
    4 H5N1亚型流感病毒的进化  40-41
    5 结语  41-42
  第二章 核酸疫苗研究进展  42-53
    1 核酸疫苗概述  42-43
    2 核酸疫苗的发展简史  43-44
    3 核酸疫苗的免疫机理  44-46
    4 增强核酸疫苗免疫效果的方法  46-49
      4.1 目的基因的选择  46
      4.2 构建高效表达的重组质粒  46-47
      4.3 接种组织的预处理  47
      4.4 免疫途径、免疫剂量和免疫次数  47-48
      4.5 免疫增强剂和佐剂  48-49
    5 核酸疫苗在畜禽领域的研究进展  49-52
    6 核酸疫苗存在的问题与展望  52-53
  第三章 犬腺病毒载体的研究进展  53-60
    1 CAV分子生物学特征  53-55
    2 CAV载体的研究进展  55-60
      2.1 腺病毒载体的优点  55
      2.2 腺病毒载体的构建  55-56
      2.3 犬腺病毒载体  56-60
        2.3.1 基因组中的外源基因插入位点  57
        2.3.2 构建方法与策略  57-60
第二篇 研究内容  60-115
  第一章 虎源H5N1亚型流感病毒HA与NP基因的克隆、测序及其核酸疫苗的构建  60-81
    1 材料与方法  61-69
      1.1 材料  61
        1.1.1 毒株、细胞、工程细菌和质粒  61
        1.1.2 主要试剂  61
        1.1.3 主要仪器  61
      1.2 实验方法  61-69
        1.2.1 感受态菌的制备(CaCl_2转化法)  61-62
        1.2.2 质粒DNA的小量制备(碱裂解法)  62
        1.2.3 质粒DNA的大量制备(碱裂解法)  62-63
        1.2.4 连接物的转化  63
        1.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳  63
        1.2.6 总RNA的提取  63
        1.2.7 HA和NP基因的扩增、克隆及测序  63-64
        1.2.8 核酸疫苗真核表达载体pVAX-HA和pVAX-NP的构建  64-65
        1.2.9 核酸疫苗真核表达载体pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP的构建  65-68
        1.2.10 所构建的四种真核表达质粒在真核细胞中的表达及检测  68-69
    2 结果  69-78
      2.1 A/TIGER/HARBIN/132/2007 (H5N1) HA和NP基因的PCR扩增、克隆和测序分析  69-72
      2.2 PVAX-HA和PVAX-NP真核表达载体的构建及鉴定  72-73
      2.3 PIRES2-IL-18-HA和PIRES2-IL-18-NP真核表达载体的构建及鉴定  73-75
        2.3.1 猫IL-18基因的PCR扩增、克隆和测序分析  73-74
        2.3.2 pIRES2-IL-18载体的构建及鉴定  74
        2.3.3 pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP真核表达载体的构建及鉴定  74-75
      2.4 所构建的四种真核表达质粒在BHK-21细胞中的表达和检测  75-78
        2.4.1 间接免疫荧光检测结果  75-76
        2.4.2 间接ELISA检测结果  76-77
        2.4.3 猫IL-18基因在真核细胞中的表达检测结果  77-78
    3 讨论  78-80
      3.1 目的基因的选择  78-79
      3.2 毒株的选择  79
      3.3 核酸疫苗表达载体的选择  79-80
    4 小结  80-81
  第二章 表达虎源H5N1流感病毒NP和HA蛋白重组犬2型腺病毒的构建与鉴定  81-95
    1 材料与方法  82-86
      1.1 材料  82
        1.1.1 病毒、细胞、细菌和质粒  82
        1.1.2 主要试剂  82
      1.2 实验方法  82-86
        1.2.1 DNA片段末端平滑化  82
        1.2.2 线性化质粒DNA片段5'末端去磷酸化  82
        1.2.3 H5N1 NP和HA表达盒转移载体的构建  82-83
        1.2.4 含H5N1 NP和H5N1 HA表达盒CAV-2基因组重组质粒的构建  83-84
        1.2.5 重组质粒pCAV-2-NP和pCAV-2-HA基因组转染DK细胞  84-85
        1.2.6 CAV-2-NP和CAV-2-HA的鉴定  85-86
    2 结果  86-92
      2.1 H5N1 NP与HA表达盒转移载体的构建  86-87
      2.2 含H5N1 NP和HA表达盒CAV-2基因组重组质粒的构建  87-88
      2.3 重组PCAV-2-NP与PCAV-2-HA基因组转染DK细胞  88-89
      2.4 CAV-2-NP与CAV-2-HA的鉴定  89-92
    3 讨论  92-94
      3.1 CAV-2载体的选择  92
      3.2 E3区缺失载体及H5N1 NP和HA表达盒转移载体的构建  92-93
      3.3 重组病毒的鉴定  93
      3.4 H5N1 NP和HA基因的转录与表达  93
      3.5 重组病毒的生长特性  93
      3.6 重组病毒的遗传稳定性  93-94
    4 小结  94-95
  第三章 核酸疫苗与重组活载体疫苗的小鼠免疫与攻毒保护性试验  95-113
    实验一 核酸疫苗的小鼠免疫与攻毒保护性试验  95-104
      1 材料与方法  96-98
        1.1 材料  96
          1.1.1 毒株与质粒  96
          1.1.2 实验动物及主要试剂  96
        1.2 方法  96-98
          1.2.1 pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP的制备  96
          1.2.2 小鼠分组与免疫  96-97
          1.2.3 攻毒  97
          1.2.4 免疫小鼠血清抗AIV抗体的检测  97-98
      2 结果  98-101
        2.1 抗AIV抗体水平检测结果  98
          2.1.1 抗AIV ELISA抗体水平检测结果  98
          2.1.2 抗AIV HI抗体检测结果  98
        2.2 免疫小鼠的脾淋巴细胞转化试验检测结果  98-99
        2.3 攻毒保护性试验结果  99-101
          2.3.1 攻毒后的临床表现  99-100
          2.3.2 核酸疫苗保护率结果  100-101
      3 讨论  101-103
        3.1 AIV核酸疫苗的免疫效果分析  101-103
          3.1.1 不同载体的核酸疫苗免疫效果的差异  101
          3.1.2 不同目的基因核酸疫苗免疫效果的差异  101-102
          3.1.3 联合免疫与单独免疫效果的差异  102
          3.1.4 关于HI试验结果  102
          3.1.5 核酸疫苗免疫效果的总体评价  102-103
        3.2 免疫实验总结与后续工作展望  103
      4 小结  103-104
    实验二 重组活载体疫苗的小鼠免疫与攻毒保护试验  104-113
      1 材料与方法  104-106
        1.1 材料  104-105
          1.1.1 毒株与疫苗  104-105
          1.1.2 实验动物及主要试剂  105
        1.2 方法  105-106
          1.2.1 小鼠分组与免疫方法  105
          1.2.2 小鼠体重变化监测  105
          1.2.3 攻毒保护实验  105
          1.2.4 攻毒后肺滴度的测定  105-106
          1.2.5 免疫小鼠血清抗AIV抗体的检测  106
      2 结果  106-110
        2.1 免疫后小鼠体重变化  106-107
        2.2 抗AIV抗体水平检测结果  107-108
          2.2.1 抗AIV ELISA抗体水平检测结果  107-108
          2.2.2 抗AIV HI抗体检测结果  108
        2.3 攻毒保护性试验结果  108-110
      3 讨论  110-112
        3.1 免疫对小鼠体重的变化  110
        3.2 重组活载体疫苗抗体水平结果分析  110-111
        3.3 不同目的基因重组活载体疫苗免疫效果的差异  111
        3.4 联合免疫与单独免疫效果的差异  111
        3.5 关于HI试验结果  111
        3.6 重组活载体疫苗免疫效果的总体评价  111-112
      4 小结  112-113
  第四章 结论  113-114
  第五章 创新点  114-115
参考文献  115-126
致谢  126-127
攻毒学位期间发表的学术论文和出版教材  127

相似论文

  1. 苹果多酚对γ射线引起的免疫系统损伤防护作用研究,S661.1
  2. 数字电路内建自测试方法的研究,TN79
  3. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. HSV-2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察,R392
  6. 微纤维相关蛋白4在肝纤维化组织中的表达和外周血浓度与肝病理分级的相关性研究,R575.2
  7. 携带WSSV凡纳滨对虾的养殖和环境因子胁迫的研究,S945
  8. HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究,R392.1
  9. 调和玉米油对肉仔鸡抗氧化应激、脂质代谢酶及免疫基因表达的影响,S831.5
  10. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  11. 植物精油对仔猪生产性能、肠道微生物及免疫性能的影响,S828.5
  12. “和美酵素”在断奶仔猪生产中的应用研究,S828.9
  13. PRRSV的感染差异性和抗体依赖性增强作用研究,S858.28
  14. 壬基酚与三丁基锡对罗氏沼虾免疫因子、卵黄蛋白原基因表达和性腺发育的影响,S945
  15. 维生素E和C对军曹鱼（Rachycentron canadum）生长性能和非特异性免疫的影响,S963.1
  16. 添加钾离子对低盐度水体养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的生长与生理特性的影响,S963
  17. 几种免疫增强剂对军曹鱼（Rachycentron canadum）生长、非特异免疫力和抗病力的影响,S963
  18. 免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立,R373
  19. 棘胸蛙非特异性免疫在多种环境胁迫下的反应特征,Q958.1
  20. 大豆细菌性斑点病原物的分离鉴定及其两个Ⅲ型效应因子的克隆与功能研究,S435.651
  21. 转attM基因彩色马蹄莲及AttM解酯酶抗体制备研究,S682.264

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
© 2012 www.xueweilunwen.com