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猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究

作　者: 孟凡丹
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒核酸疫苗免疫
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 238次
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内容摘要

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染可造成以仔猪急性肠炎,腹泻和死亡为主要症状的猪传染性胃肠炎(TGE)和流行性腹泻(PED)。有效防治措施是疫苗接种。当前应用的TGE和PED疫苗在疫苗稳定性、安全性及保护率等方面还有一定的不足;同时这两种疾病发病机制还不是十分清楚,导致这两种疾病仍对养猪业影响严重。因此,研制新型有效的用于防治TGEV和PEDV的疫苗具有实践意义。纤突蛋白(S)是TGEV和PEDV表面突起的糖蛋白,可以诱导动物机体免疫系统产生特异性的中和抗体并且能够介导病毒与细胞膜上特异受体结合,参与细胞膜融合等过程,是作为主要免疫保护性抗原的主要候选基因。核酸疫苗具有成分明确、成本低廉、便于储藏运输等优点。以前的研究已经表明TGEV S基因N端部分(2106bp)(TGEV S1)比全长S基因免疫效果更好;而目前没有关于PEDV S基因核酸疫苗的报道。因此本研究构建了同时编码TGEV S1和PEDV S1(pIRES-T1-P1)以及TGEV S1和PEDV S(pIRES-T1-P2)两个二联核酸疫苗。用脂质体法转染到BHK-21细胞中,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测两个重组质粒在真核细胞中的表达情况。结果表明两个重组质粒编码的三种蛋白均能在真核表达系统中表达。在此基础上,利用6-8周龄的昆明鼠进行免疫特性研究。取小鼠脾脏和外周血淋巴细胞测定淋巴细胞增殖,淋巴细胞CTL活性;取小鼠血清检测了病毒中和抗体,干扰素-γ,用间接ELISA方法检测了TGEV/PEDV特异性抗体IgG含量等指标。利用流式细胞术对T淋巴细胞亚群数量动态变化进行了检测。动物实验结果表明:二联核酸疫苗明显增加了T淋巴细胞的增殖能力和CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量,并能够诱导机体产生较高水平的IFN-γ。免疫后42天pIRES-T1-P2组能够产生明显的特异性CTL活性。在免疫后35天均能够刺激机体产生较高的抗体水平,并诱导机体产生特异性中和抗体。本研究为TGE和PED二联核酸疫苗研发提供参考。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 前言  11-19
  1.1 猪传染性胃肠炎（TGE）研究现状  11-13
    1.1.1 病原学  11-12
    1.1.2 TGEV S 蛋白研究进展  12-13
    1.1.3 临床症状  13
  1.2 猪流行性腹泻（PED）研究现状  13-15
    1.2.1 病原学  13-14
    1.2.2 PEDV S 蛋白研究进展  14-15
    1.2.3 临床症状  15
  1.3 疫苗研究现状  15-17
    1.3.1 灭活疫苗  15
    1.3.2 弱毒疫苗  15-16
    1.3.3 基因工程疫苗  16-17
  1.4 本研究的目的和意义  17-19
2 材料与方法  19-40
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 实验动物  19
    2.1.2 菌种与载体  19
    2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒  19
    2.1.4 标准参照物  19
    2.1.5 主要生化试剂  19-20
    2.1.6 大提质粒主要溶液的配制  20
    2.1.7 培养基的配制  20
    2.1.8 间接ELISA 检测主要试剂  20-21
    2.1.9 间接免疫荧光主要试剂  21
    2.1.10 感受态菌的制备  21
    2.1.11 仪器设备  21-22
  2.2 实验方法  22-39
    2.2.1 真核表达载体构建  22-32
    2.2.2 pIRES-T1-P1; pIRES-T1-P2 重组真核质粒体外瞬间转染及其表达产物检测  32
    2.2.3 pIRES-T1-P1; pIRES-T1-P2 重组质粒免疫小鼠及其免疫效果的检测  32-39
  2.3 数据处理  39-40
3 结果  40-58
  3.1 重组质粒pIRES-T1-P1 和pIRES-T1-P2 PCR 及酶切鉴定  40-41
    3.1.1 重组质粒pIRES-T1 单酶切和PCR 鉴定  40
    3.1.2 重组质粒pIRES-T1-P1 双酶切和PCR 鉴定  40-41
    3.1.3 重组质粒pIRES-T1-P2 双酶切和PCR 鉴定  41
  3.2 间接免疫荧光检测真核表达质粒体外瞬时转染效果  41-43
  3.3 小鼠脾脏及外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  43-47
    3.3.1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化  43-45
    3.3.2 小鼠外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化  45-47
  3.4 小鼠脾脏及外周血不同亚型T 淋巴细胞动态变化  47-51
    3.4.1 小鼠脾脏及外周血CD4~+T 淋巴细胞动态变化  47-49
    3.4.2 小鼠脾脏及血液CD8~+T 淋巴细胞动态变化  49-51
  3.5 免疫小鼠脾脏及血液特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  51-52
    3.5.1 免疫小鼠脾脏特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  51
    3.5.2 免疫小鼠外周血特异性细胞毒性T 淋巴细胞活性检测  51-52
  3.6 小鼠外周血抗TGEV S /PEDV S IgG 抗体含量动态变化  52-54
    3.6.1 小鼠外周血抗TGEV S IgG 抗体含量动态变化  52-53
    3.6.2 小鼠外周血抗PEDV S IgG 抗体含量动态变化  53-54
  3.7 小鼠外周血IFN-γ的检测  54
  3.8 小鼠外周血IL-4 的检测  54-55
  3.9 小鼠外周血中和抗体的检测  55-58
    3.9.1 TGEV 中和抗体检测  55-56
    3.9.2 PEDV 中和抗体检测  56-58
4 讨论  58-65
  4.1 TGEV S 和PEDV S 的重组质粒联合免疫设计  58-59
  4.2 表达载体对核酸疫苗免疫效果的影响  59
  4.3 重组真核表达载体体外瞬时转染结果分析  59-60
  4.4 小鼠免疫重组二联核酸疫苗后T 淋巴细胞增殖效果及活性的评估  60-63
    4.4.1 T 淋巴细胞增殖情况  60-61
    4.4.2. T淋巴细胞CD4~+，CD8~+亚群动态变化及特异性T 淋巴细胞毒性检测  61-62
    4.4.3 细胞因子IFN-γ，IL-4 生成水平  62-63
  4.5 小鼠免疫重组二联核酸疫苗后抗TGEV/PEDV IgG 抗体含量动态变化  63-64
  4.6 小鼠免疫重组二联核酸疫苗后中和抗体测定  64-65
5 结论  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-74
攻读硕士学位期间发表的学术论文  74

猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究

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