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棘胸蛙非特异性免疫在多种环境胁迫下的反应特征

作　者: 王存盼
导　师: 鲍毅新；颉志刚
学　校: 浙江师范大学
专　业: 生态学
关键词: 非特异性免疫棘胸蛙生境压力细菌刺激冬眠温度
分类号: Q958.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

两栖动物种群数量下降已经受到人们的广泛关注,其原因可能是复杂多变的,除了栖息地破坏、过度捕捉、环境污染、紫外辐射增多等因素外,疾病传播可能是导致其数量减少的直接原因,全球气候变暖可能也是导致其数量减少的原因之一。作为变温动物,冬眠是两栖动物适应低温及食物匮乏环境的一种有效策略,对两栖动物的生存有着重要意义。但随着气候变暖,暖冬现象可能会干扰其正常冬眠,对其正常的生理功能造成一定的影响。免疫系统在抵御病原体入侵保护机体免受疾病侵袭方面起着重要作用,对有机体的生存有着举足轻重的意义,但目前有关两栖类的免疫学资料相对较少,各种胁迫因子对蛙类的免疫功能的影响及其相关机制方面的研究更少,暖冬现象对两栖类的免疫功能的影响国内外尚未见报道。本文选取野生数量已急剧减少、人工养殖工作尚在探索阶段的大型经济蛙类——棘胸蛙为研究对象,建立非特异性免疫指标测定方法并将其作为野生与养殖棘胸蛙生境压力的评价指标,研究了其生境压力；以注射经高温灭活的大肠杆菌的方式来模拟病原入侵导致的炎症反应,研究该蛙在细菌挑战状态下其免疫反应的动态特征和变化规律；在实验室条件下设置不同温度进行人工冬眠实验,检测了非特异性免疫指标的变化情况,主要结果如下：(1)建立了非特异性免疫指标测定方法,并用这些指标评价野生与养殖棘胸蛙的生境压力,结果显示养殖棘胸蛙与野生棘胸蛙胃溶菌酶活力有极显著差异(P<0.01),前者胃溶菌酶活力极显著高于后者,说明养殖棘胸蛙较野生棘胸蛙具有更高的杀菌能力,这与它们的生境压力是一致的。由于养殖密度较高,养殖过程中棘胸蛙经常会受到拥挤及水体中悬浮颗粒物的胁迫,其受细菌等病原体感染的可能性也远超过野生个体,因此具有较高的杀菌能力对其生存是必要的,是养殖个体对高密度养殖环境的一种适应策略。所以这种溶菌酶活力的差异能够在一定程度上反映养殖棘胸蛙与野生棘胸蛙生境压力的差异,可以作为养殖与野生棘胸蛙生境压力的评价指标。(2)为模拟细菌感染后机体的炎症反应状态,将养殖棘胸蛙腹腔注射灭活大肠杆菌,于注射后1h、3h、6h、12h、24h取样测定脏器系数及血细胞吞噬、巨噬细胞呼吸爆发及溶菌酶活力3个免疫指标,结果显示,脾巨噬细胞呼吸爆发在3h即显著增强,6h时达到最大后逐渐降低,24h时恢复至初始水平,血细胞吞噬能力也出现升高后又逐渐恢复的趋势,说明养殖棘胸蛙在受到细菌性刺激后其机体非特异免疫反应迅速,积极抵御病菌入侵。但各种免疫反应存在明显的时效性和差异性。(3)在12℃和4℃条件下人工诱导野生及养殖棘胸蛙冬眠,于冬眠期第30d,60d,90d取样测定指标。结果发现12℃对野生棘胸蛙具有强烈的致死作用,初步证明暖冬现象会干扰野生棘胸蛙的正常冬眠,而对养殖棘胸蛙的存活率没有影响,推测可能是由于长期驯化养殖棘胸蛙已经能够适应较高的冬眠温度。野生棘胸蛙在冬眠过程中脾系数、NBT反应强度、胃溶菌酶活力均下降,养殖棘胸蛙在冬眠过程中NBT反应强度及胃溶菌酶活力也下降,说明野生棘胸蛙及养殖棘胸蛙在冬眠期间都存在免疫系统结构退化、机能抑制。野生棘胸蛙在冬眠过程中的血细胞吞噬能力持续增强,养殖棘胸蛙与野生棘胸蛙有些类似,其血细胞吞噬能力出现先下降后增强的趋势,我们推测这可能与吞噬细胞所占比例的增加有关,说明长期冷暴露或冬眠过程中,吞噬细胞在免疫防御中起着更为重要的作用,随着脾脏免疫功能的逐渐减弱,这种吞噬能力的增强能够起到一定的免疫补偿。野生棘胸蛙冬眠1个月时12℃冬眠组脾系数显著大于4℃冬眠组,体现了免疫器官的温度依赖性。在NBT反应体系中加入LPS刺激发现,野生棘胸蛙2个冬眠组刺激增长指数存在显著差异,4℃冬眠组的刺激增长指数显著高于12℃冬眠组,该结果初步说明野生棘胸蛙在较高的冬眠温度下无法快速响应外源细菌性刺激,这可能是导致其高死亡率的原因之一。养殖棘胸蛙冬眠第1个月末12℃冬眠组脾系数极显著大于4℃冬眠组,NBT反应强度也极显著大于4℃冬眠组,说明12℃冬眠组的脾脏免疫功能较4℃冬眠组强,这可能也与其高存活率有关,说明较高的冬眠温度会抑制脾脏免疫功能的减弱而使养殖棘胸蛙的免疫功能维持在相对较高的水平,更有利于其存活。该结果与野生棘胸蛙对不同冬眠温度的免疫效应有所差异。养殖棘胸蛙与野生棘胸蛙对同一冬眠温度的免疫应答所出现得差异也可能是长期的驯化作用引起的。通过以上研究,可以初步探索炎症反应下棘胸蛙的免疫动态变化过程及暖冬对棘胸蛙种群衰退的影响,对于揭示两栖动物种群衰退原因有重要意义；也可以丰富和完善蛙类免疫学研究资料,尤其对我国重要的具有科研、经济价值的蛙类的研究具有重要意义；还可以为棘胸蛙的人工养殖提供技术指导。

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摘要 4-6Abstract 6-9目录 9-11第一章文献综述 11-24 1. 两栖动物生存现状 11-12 2. 两栖类免疫系统研究进展 12-21 2.1 非特异性免疫研究进展 12-19 2.1.1 皮肤分泌物 13 2.1.2 溶菌酶 13-14 2.1.3 补体系统 14-16 2.1.4 吞噬细胞 16-18 2.1.5 红细胞的免疫功能 18-19 2.2 特异性免疫研究进展 19-21 3. 棘胸蛙简介 21 4. 研究目的及意义 21-24第二章非特异性免疫指标作为野生与养殖棘胸蛙生境压力评价指标的研究 24-32 1. 引言 24-25 2. 材料及方法 25-28 2.1. 材料 25 2.1.1 实验动物 25 2.1.2 主要试剂 25 2.1.3 主要仪器 25 2.2 方法 25-28 2.2.1 实验动物选择与驯化 25 2.2.2 取样测定 25-28 2.2.3 数据统计 28 3 实验结果 28-29 3.1 身体状况指数 28-29 3.2 非特异性免疫功能 29 4 讨论 29-32第三章细菌刺激对养殖棘胸蛙免疫功能的影响 32-40 1. 引言 32-33 2. 材料及方法 33-35 2.1. 材料 34 2.1.1 实验动物 34 2.1.2 主要试剂 34 2.1.3 主要仪器 34 2.2 方法 34-35 2.2.1 试验设计 34-35 2.2.2 免疫指标测定 35 2.2.3 数据统计 35 3. 实验结果 35-37 4. 讨论 37-40第四章不同冬眠温度对棘胸蛙免疫功能的影响 40-52 1. 引言 40-41 2. 材料及方法 41-42 2.1 材料 41 2.1.1 实验动物 41 2.1.2 主要试剂 41 2.1.3 主要仪器 41 2.2 方法 41-42 2.2.1 实验动物驯化 41-42 2.2.2 试验设计 42 2.2.3 取样测定 42 2.2.4 数据统计 42 3. 实验结果 42-49 3.1 野生棘胸蛙冬眠结果 42-46 3.1.1 人工冬眠期存活情况 42-43 3.1.2 免疫功能的变化特征 43-46 3.2 养殖棘胸蛙冬眠结果 46-49 3.2.1 人工冬眠期存活情况 46 3.2.2 免疫功能的变化特征 46-49 4. 讨论 49-52 4.1 冬眠低温或长期冷暴露对脊椎动物免疫功能的影响 49-50 4.2 不同冷暴露温度对脊椎动物免疫功能的影响 50-51 4.3 温度驯化对脊椎动物免疫功能的影响 51-52第五章小结与展望 52-54参考文献 54-66致谢 66-67攻读硕士学位期间发表的学术论文 67攻读硕士学位期间参加的学术会议 67-68

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