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薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

作　者: 秦江瑜
导　师: 刘欣
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: H9c2心肌细胞 缺氧/复氧 氧化应激 细胞凋亡 线粒体膜电位 HSP70
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的研究薯蓣皂苷(dioscin, Dio)对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制。方法建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,并用薯蓣皂苷进行干预。将培养的大鼠H9c2心肌细胞随机分为5组,正常对照组(C组)；缺氧/复氧模型组(H/R组)；缺氧/复氧模型+薯蓣皂苷低、中、高剂量(10mg/L、20mg/L、40mg/L)干预组(H/R+L、M、H组)。1.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法测定细胞存活率。2.收集培养细胞上清液,分别测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。3.应用荧光探针DCFH-DA标记细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS),荧光显微镜下观察各组心肌细胞内活性氧水平。4.采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色法,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.用罗丹明123((Rhodamine123, Rh123)荧光探针标记线粒体,多功能标记仪检测荧光强度以反映细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化。6.采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞内细胞色素C(cytochrome c, Cyt-c)释放量。7.应用RT-PCR方法检测细胞凋亡相关基因Bax、Bc1-2、caspase-9、caspase-3 mRNA的表达。8.应用Western blot法检测热休克蛋白70(heat-shock protein 70, HSP70)的表达。结果1.细胞存活率：与H/R组比较,C组心肌细胞存活率有统计学差异(34.50±8.50% vs 100.00±00.00%,P<0.01),H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞存活率(34.50±8.50% vs 66.47±10.56%,76.19±7.57%,93.38±6.09%,P<0.01)；且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。2. LDH活性：与H/R组比较,C组心肌细胞LDH活性有统计学差异(1287.68±58.97U/Lvs975.29±35.66U/L,P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显降低心肌细胞LDH活性(1287.68±58.97 U/L vs 1150.85±40.67 U/L, 1078.79±48.94 U/L,1001.65±53.05 U/L, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。SOD活性：与H/R组比较,C组心肌细胞SOD活性有统计学差异(17.36±1.12 U/ml vs 23.55±1.19 U/ml, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞SOD活性(17.36±1.12 U/ml vs 19.59±0.60 U/ml,21.08±0.63 U/ml, 22.56±0.59U/ml,P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L组有统计学差异(P<0.05)。MDA含量：与H/R组比较,C组心肌细胞MDA含量有统计学差异(2.88±0.04 nmol/ml vs 2.49±0.03 nmol/ml, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显降低心肌细胞MDA含量(2.88±0.04 nmol/ml vs 2.72±0.06 nmol/ml,2.66±0.05 nmol/ml,2.59±0.03 nmol/ml, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。3.活性氧：荧光显微镜下,Rosup活性氧阳性对照组荧光强度最高,H/R组荧光强度较高,与H/R组比较,H/R+L、H/R+M、H/R+H组均可降低细胞荧光强度、减低细胞内活性氧水平。4.细胞凋亡率：与H/R组比较,C组心肌细胞凋亡率有统计学差异(10.61±1.00% vs 0.15±0.04%,P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显减低心肌细胞凋亡率(10.61±1.00% vs 2.03±0.06%,1.80±0.06%,1.67±0.04%, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<O.05,P<0.01)。5.△Ψm荧光强度：与H/R组比较,C组心肌细胞线粒体膜电位有统计学差异(106547±5907 vs 205486±4653, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞线粒体膜电位(106547±5907 vs 160835±3521,186350±3353, 194694±3043,P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<O.01)。6.Cyt-c释放量：与H/R组比较,C组细胞内Cyt-c量差异具有统计学意义(p<0.01),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞线粒体内Cyt-c释放量(p<0.01)；与H/R+H组比较,H/R+L组(p<0.05),各给药组的作用呈显著浓度相关性。7. Bax、Bcl-2 mRNA的表达：与H/R组比较,C组细胞Bax、Bcl-2 mRNA的表达差异具有统计学意义(P<0.05),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞Bax mRNA的表达(p<0.01),并能升高Bcl-2 mRNA的表达(p<0.05)；与H/R+H组比较,H/R+L组(P<0.05),各给药组的作用呈显著浓度相关性。caspase-9、caspase-3 mRNA的表达：与H/R组比较,C组细胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表达差异具有统计学意义(p<0.01),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表达(P<0.01)；与H/R+H组比较,H/R+L组(P<0.01),各给药组的作用呈显著浓度相关性。8. HSP70的表达：与H/R组比较,C组细胞HSP70的表达差异具有统计学意义(p<0.05),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可明显升高心肌细胞内HSP70的表达(p<0.05)；与H/R+H组比较,H/R+L组(p<0.01),各给药组的作用呈显著浓度相关性。结论1.薯蓣皂苷可有效减少缺氧/复氧损伤的大鼠H9c2心肌细胞LDH漏出量,提高细胞存活率。2.薯蓣皂苷可通过抗氧化作用有效保护缺氧/复氧对大鼠H9c2心肌细胞的损伤。3.薯蓣皂苷可通过抗凋亡作用有效保护缺氧/复氧对大鼠H9c2心肌细胞的损伤。4.薯蓣皂苷可增加缺氧/复氧损伤后大鼠H9c2心肌细胞HSP70的表达来有效保护细胞。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-14
缩略语  14-16
前言  16-19
  研究现状、成果  16-18
  研究目的、方法  18-19
一、薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响  19-27
  1.1 对象和方法  19-23
    1.1.1 实验材料  19-21
    1.1.2 实验方法  21
    1.1.3 观测指标  21-23
    1.1.4 统计学方法  23
  1.2 结果  23-25
    1.2.1 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞存活率的影响  23-24
    1.2.2 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞上清液中LDH活性的影响  24-25
  1.3 讨论  25-26
    1.3.1 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞存活率的影响  25-26
    1.3.2 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞上清液中LDH活性的影响  26
  1.4 小结  26-27
二、薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤抗氧化能力的影响  27-37
  2.1 对象和方法  27-30
    2.1.1 实验材料  27
    2.1.2 实验方法  27
    2.1.3 观测指标  27-30
    2.1.4 统计学方法  30
  2.2 结果  30-33
    2.2.1 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞内活性氧的影响  30-31
    2.2.2 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞上清液中SOD活性的影响  31-32
    2.2.3 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞上清液中MDA含量的影响  32-33
  2.3 讨论  33-36
    2.3.1 活性氧与心肌缺血/再灌注损伤  33-34
    2.3.2 心肌的抗氧化损伤机制  34-36
    2.3.3 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤抗氧化能力的影响  36
  2.4 小结  36-37
三、薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤抗凋亡能力的影响  37-62
  3.1 对象和方法  37-44
    3.1.1 实验材料  37-38
    3.1.2 实验方法  38
    3.1.3 观测指标  38-43
    3.1.4 统计学方法  43-44
  3.2 结果  44-52
    3.2.1 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞凋亡存活率的影响  44-46
    3.2.2 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤线粒体膜电位(△ψm)的影响  46-47
    3.2.3 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞内Cyt-c释放量的影响  47-48
    3.2.4 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤细胞内凋亡相关基因Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3 mRNA的表达的影响  48-52
  3.3 讨论  52-61
    3.3.1 心肌缺血/再灌注损伤与心肌细胞凋亡  52-53
    3.3.2 心肌缺血/再灌注损伤中细胞凋亡信号转导通路  53-55
    3.3.3 线粒体通路与心肌细胞凋亡  55-58
    3.3.4 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤抗凋亡能力的影响  58-61
  3.4 小结  61-62
四、薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护性蛋白HSP70表达的影响  62-70
  4.1 对象和方法  62-66
    4.1.1 实验材料  62-63
    4.1.2 实验方法  63
    4.1.3 观测指标  63-66
    4.1.4 统计学方法  66
  4.2 结果  66-67
    4.2.1 薯蓣皂苷对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护性蛋白HSP70表达的影响  66-67
  4.3 讨论  67-69
  4.4 小结  69-70
结论  70-71
参考文献  71-79
发表论文和参加科研情况说明  79-80
综述 线粒体功能障碍与动脉粥样硬化  80-87
  综述参考文献  84-87
致谢  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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