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猪囊尾蚴TSOL18核酸疫苗表达载体构建、免疫原性及安全性研究

作　者: 刘斌
导　师: 刘英；才学鹏
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪囊尾蚴 DNA疫苗 TSOL18基因核酸疫苗表达载体免疫原性安全性
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪等中间宿主而引起的人畜共患寄生虫病,在中国大部分地区广泛流行,严重威胁着当地居民的身体健康,是一个重要的公共卫生问题。不仅如此,该病也是制约养猪业发展的重要因素,还给畜牧业生产造成重大经济损失,囊虫病的广泛存在还造成畜牧业的重大经济损失,极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,因而是公认的社会经济病之一。1.本实验将猪带绦虫六钩蚴阶段TSOL18基因定向克隆于真核表达质粒pVAX1,经筛选、鉴定及DNA序列分析正确后,将重组质粒pVAX1/TSOL18转染BHK-21细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光抗体染色,检测细胞中表达的TSOL18抗原。结果表明,重组真核质粒pVAX1/TSOL18可在BHK-21细胞中表达,表达的TSOL18目的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。动物免疫试验表明,真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,这为猪囊尾蚴病核酸疫苗的研究奠定了良好的基础。2.探讨pVAX1/TSOL18重组表达质粒作为DNA疫苗在小鼠体内的组织分布和生物安全性。将pVAX1/TSOL18重组质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间剖杀小鼠,分别采集各种组织样品,抽提gDNA,利用PCR技术分析pVAX1/TSOL18在组织内的分布及残留时间;同时,以PCR技术检测免疫动物粪便,分析pVAX1/TSOL18重组表达质粒在外界环境中的释放情况。结果显示,免疫pVAX1/TSOL18重组表达质粒1d和5d后,在小鼠组织gDNA均扩增出目的片段,但不同个体的小鼠,扩增出的目的片段的组织也不完全相同,但在血液中均扩增出了目的片段,第5d较第1d扩增出的目的片段明显变暗;免疫后15d,仅在一只小鼠的血液中检测到TSOL18基因;免疫后30d在所有动物组织中均未检测到重组表达质粒;同时,免疫1d、5d小鼠的粪便中均未检测到TSOL18基因。pVAX1/TSOL18重组表达质粒作为疫苗对动物和环境是安全的。

全文目录

摘要  3-4
Summary  4-8
第一章文献综述  8-24
  引言  8
  1 猪囊尾蚴的概况  8-9
    1.1 猪囊尾蚴的发展史  8
    1.2 猪囊尾蚴的危害  8-9
  2 猪囊尾蚴病的流行现状  9-11
    2.1 国外流行现状  9-10
    2.2 国内流行现状  10-11
  3 猪囊尾蚴药物防治  11
  4 猪囊尾蚴免疫预防研究进展  11-18
    4.1 传统的疫苗研究  11-13
      4.1.1 囊尾蚴虫体抗原疫苗  11-12
      4.1.2 六钩蚴虫体抗原疫苗  12
      4.1.3 异源性抗原  12
      4.1.4 分泌/代谢抗原疫苗  12-13
    4.2 新型猪囊尾蚴疫苗  13-18
      4.2.1 猪囊尾蚴组织细胞苗  13
      4.2.2 基因工程疫苗  13-15
      4.2.3 核酸疫苗  15-16
      4.2.4 多肽疫苗  16-17
      4.2.5 其他新型疫苗的研究  17-18
  5 展望  18-19
  参考文献  19-24
第二章猪囊尾蚴TSOL18 核酸疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究  24-41
  1 材料和方法  25-35
    1.1 实验动物与实验材料  25-27
      1.1.1 实验动物  25
      1.1.2 重组表达质粒、菌株、引物和主要试剂  25
      1.1.3 溶液  25-26
      1.1.4 仪器与设备  26-27
    1.2 实验方法  27-31
      1.2.1 引物的设计和合成  27
      1.2.2 目的基因TSOL18 的获得  27-29
      1.2.3 真核表达质粒的构建  29-30
      1.2.4 重组质粒的提取与鉴定  30
      1.2.5 序列测定及分析  30-31
    1.3 间接免疫荧光试验  31-33
      1.3.1 BHK-21 细胞的复苏与传代  31
      1.3.2 BHK-21 细胞的转染  31
      1.3.3 间接免疫荧光检测  31
      1.3.4 SDS-PAGE 检测  31-32
      1.3.5 Western blotting 检测  32-33
    1.4 质粒大量提取  33-34
      1.4.1 pVAX1/TSOL18 重组真核表达质粒的大量扩增  33
      1.4.2 细菌的收获  33
      1.4.3 质粒的大量提取（碱裂解法）  33-34
    1.5 动物免疫试验  34-35
      1.5.1 动物免疫试验分组  34
      1.5.2 间接ELISA 分别检测抗猪囊尾蚴抗体  34-35
      1.5.3 T 淋巴细胞增殖试验  35
  2 结果  35-39
    2.1 目的基因的获得  35-36
    2.2 真核表达质粒的构建及鉴定  36
    2.3 重组质粒的序列测定及分析  36-37
    2.4 间接免疫荧光检测结果  37
    2.5 SDS-PAGE 及Western blotting 检测结果  37-38
    2.6 核酸疫苗表达载体免疫鼠血清抗体检测  38-39
    2.7 核酸疫苗免疫鼠淋巴细胞转化试验  39
  3 讨论  39-41
第三章猪囊尾蚴核酸疫苗pVAX1/TSOL18 的安全性研究  41-50
  1 材料和方法  42-46
    1.1 实验动物与材料  42
      1.1.1 实验动物  42
      1.1.2 重组表达质粒、菌株、引物和主要试剂  42
    1.2 溶液  42-43
    1.3 仪器与设备  43
    1.4 pVAX1/TSOL18 重组表达质粒的大量提取  43
      1.4.1 pVAX1/TSOL18 重组真核表达质粒的大量扩增  43
      1.4.2 细菌的收获  43
      1.4.3 质粒的大量提取（碱裂解法）  43
    1.5 试验动物及其分组  43
    1.6 临床观察  43
    1.7 免疫鼠组织DNA 的提取  43-45
      1.7.1 组织中动物基因组提取  44
      1.7.2 粪便中动物基因组提取  44-45
    1.8 pVAX1/TSOL18 重组表达质粒在小鼠体内的残留时间和分布范围  45-46
  2 结果  46-48
    2.1 pVAX1/TSOL18 重组表达质粒的大量提取  46
    2.2 临床观察  46
    2.3 基因组的DNA 提取  46
    2.4 pVAX1/TSOL18 重组质粒在小鼠体内的残留时间及分布范围  46-48
  3 讨论  48-50
参考文献  50-53
研究结论  53-54
附录  54-55
致谢  55-56
作者简介  56-57
导师简介  57-59

猪囊尾蚴TSOL18核酸疫苗表达载体构建、免疫原性及安全性研究

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