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泛素—蛋白酶体抑制剂诱导头颈部鳞癌细胞凋亡的实验研究

作　者: 刘宪斌
导　师: 张彬
学　校: 泰山医学院
专　业: 外科学
关键词: 泛素-蛋白酶体抑制剂 MG-132 内质网应激 Tca-8113细胞凋亡泛素蛋白连接酶
分类号: R739.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的探讨内质网应激在泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132诱导人舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞凋亡中的作用及其相关机制。方法使用含10%胎牛血清的RPMI-1 640培养基常规培养Tca-8113细胞,将指数生长期细胞随机分为5组：培养液中分别加入1640培养基(阴性对照组)、毒胡萝卜素5μmol/L(阳性对照组)、和10、20、30μmol/L的MG-1 32组。继续培养18h后,进行如下实验：MTT实验在490nm波长下测吸光度,检测MG-132对Tca-8113细胞活性的影响；采用荧光染料Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞核染色质的形态学改变;琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞中DNA ladder的形成;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；RT-PCR检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)、caspase-12 mRNA的表达；Western blotting检测葡萄糖调节蛋白78、caspase-12蛋白的表达;ELISA检测人泛素蛋白连接酶E3浓度。结果MTT实验：阴性对照组、毒胡萝卜素组和低、中、高浓度MG-132组的吸光度分别为0.515±0.265、0.170±0.690、0.292±0.420、0.222±0.106、0.148±0.205,与阴性对照组比较,均有统计学意义,其中低浓度MG-132组P<0.05,其余各组P<0.01;Hoechst 33258染色结果显示：毒胡萝卜素组、和10、20、30μmol/L的MG-132组细胞出现典型的细胞核染色质凋亡形态,且Tca-8113细胞凋亡形态学的改变与MG-132存在浓度依赖性；DNA片断化检测：MG-132各组和毒胡萝卜素组梯形条带灰度较对照组明显增加,并有浓度依赖关系,尤其以高浓度组明显;流式细胞仪检测：阴性对照组、毒胡萝卜素组和MG-132各实验组凋亡率分别为0.43±0.25%、8.49±0.25%、1 3.50±0.41%、1 9.55±0.32%和34.74±0.50%;RT-PCR检测结果：MG-1 32可引起GRP78、caspase-12的mRNA表达增强；Western-blot检测结果：MG-132可引起GRP78、caspase-12的蛋白表达增强：ELISA检测结果：阴性对照组、毒胡萝卜素组和MG-1 32实验组人泛素连接酶E3的表达量分别为40.88±4.52、38.96±0.33、28.75±2.28、1 8.16±0.65和8.85±0.72。结论1、泛素-蛋白酶体抑制剂MG-1 32可诱导人舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞的凋亡;2、MG-132可引起Tca-8113细胞的内质网应激,表现在GPR78的mRNA及蛋白的表达增加;3、MG-132可引起Tca-8 113细胞内质网应激反应性凋亡,表现在剪切、活化procaspase-12,提升caspase-12 mRNA及蛋白的表达;4、MG-132可抑制人泛素连接酶E3的表达,这一点不同于内质网应激的典型诱导剂毒胡萝卜素。意义本研究探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132诱导人舌鳞癌细胞Tca-8113凋亡的作用及其与内质网应激途径诱导细胞凋亡的关系,揭示泛素-蛋白酶体通路在肿瘤细胞凋亡中的作用及其可能的机制,为泛素-蛋白酶体抑制剂应用于头颈部鳞癌的治疗提供理论依据的同时,也为肿瘤治疗拓展了新的思路。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
符号说明  7-8
前言  8-11
材料与方法  11-25
结果  25-30
讨论  30-43
结论  43-44
附图  44-48
参考文献  48-53
综述  53-59
  参考文献  57-59
致谢  59-60
攻读学位期间发表的学术论文  60-61

泛素—蛋白酶体抑制剂诱导头颈部鳞癌细胞凋亡的实验研究

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