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小麦三雌蕊突变体幼穗中基因的差异表达分析

作　者: 杨在君
导　师: 彭正松；周永红
学　校: 四川农业大学
专　业: 植物资源保护与利用
关键词: 小麦 三雌蕊突变体 基因差异表达 抑制性差减杂交 引物退火控制技术 荧光定量PCR RT-PCR RACE RING finger泛素蛋白连接酶基因 内切-1，4-β-葡聚糖酶基因
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


小麦是世界上最重要的粮食作物之一。随着人口的剧增,可耕种土地的减少,目前世界小麦的产量已呈逐年下滑的趋势,因此当前小麦育种的主要目标仍然是增加小麦产量。增加小麦穗粒数是增加产量的一条有效途径,而小麦穗粒数是小麦花分化、发育、退化与结实等一系列生理过程的最终体现。小麦三雌蕊突变体(TP)是由彭正松先生培育出的一新的突变体,TP是由一对显性核基因控制,与细胞质遗传无关。三雌蕊突变体与Murai等发现的雄蕊雌蕊化品系不同,三雌蕊突变体具有3个正常的雄蕊和3个可育的雌蕊,一朵小花可结三粒种子,能显著的增加穗粒数,因而具有一定的育种学价值。利用微卫星(SSR)分析已将控制三雌蕊性状的Pis1基因定位于2D染色体的长臂上。小麦三雌蕊突变体是研究小麦雌蕊发育的理想材料,虽然目前小麦三雌蕊突变体的遗传基础基本清楚,但控制三雌蕊发生的Pis1基因的DNA序列信息尚不清楚。三雌蕊性状的发生是受一显性单基因控制,但该基因会引发一系列基因的表达差异。因此可以肯定的是三雌蕊性状的形成是一系列基因的差异表达的结果,因此本研究的目的是分离小麦三雌蕊突变体在幼穗发育过程中差异表达的基因。主要研究结果如下：1.以三雌蕊突变体(TP)为供体,单雌蕊地方品种中国春(CS)、川麦28(CM28)、绵阳29(MY29)、内麦9号(NM9)为轮回亲本,经7代回交,4代自交,初步培育出三雌蕊近等基因系CSTP, CM28TP, MY29TP, NM9TP。利用128对SRAP引物对培育的近等基因系及轮回亲本进行SRAP分析,结果表明：(1)128对引物共扩增出978个条带。其中有120对引物的扩增产物具有多态性,占所用引物的93.8%。这120对引物共扩增出638个差异条带,占总条带数的65.2%;(2)利用128对SRAP引物计算9个材料之间的遗传相似系数。其中CS与CSTP的相似系数为0.9346,MY29与MY29TP的遗传相似系数为0.9070,CM28与CM28TP的遗传相似系数为0.9397,NM9与NM9TP的遗传相似系数为0.8732。(3)通过聚类分析筛选出两对遗传相似性大于0.93的近等基因系,即CM28TP与CM28、CSTP与CS。2.利用两对三雌蕊性状的近等基因系CM28TP和CSTP以及它们的轮回亲本构建了小麦三雌蕊性状的正向抑制性差减杂交cDNA文库。从CM28TP cDNA文库中分离出62个差异表达基因,其中30个基因为已知基因,它们编码的蛋白质主要用于调控蛋白合成、信号转导以及离子运输等。其余32个基因为未知基因。从CSTP cDNA文库中分离出161个差异表达基因,其中67%的基因为未知基因,剩下的33%的基因为已知基因。通过序列比对发现有四个基因,即：硫氧还蛋白H,泛素连接酶,微小染色体维持蛋白2(MCM2),和泛醇细胞色素C还原酶复合体14kD蛋白在两个近等基因系CM28TP和CSTP中均过量表达。虽然CM28TP和CSTP具有不同的遗传背景,但它们都表现为三雌蕊性状,因此推测这四个基因与三雌蕊的发育相关。3.利用引物退火控制技术对小麦三雌蕊性状的两对近等基因系CM28TP和CSTP及其轮回亲本CM28和CS幼穗中差异表达基因进行分离。利用120条ACP引物,我们从CM28TP和CSTP中分离出3个差异表达基因,并将其分别命名为DETP-1, DETP-2和DETP-3。通过Blastx比对分析发现,DETP-1与玉米中的细胞质膜蛋白基因同源,而细胞质膜蛋白在细菌中的功能是调控细胞分化。DETP-3与玉米的内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)基因同源。EGases基因在植物的发育、细胞壁的收缩、花轴及根的延长方面起作重要的作用。DETP-2在Genebank中没有找到与之同源的基因,可能是一新的基因。通过Real-time PCR分析,DETP-1, DETP-2和DETP-3在CM28TP和CSTP中的表达量均高于其轮回亲本CM28和CS,因此推测这三个基因可能与三雌蕊的发育有关。4.利用RT-PCR技术从小麦三雌蕊突变体(TP)中克隆出一个RING finger泛素蛋白连接酶基因的全长cDNA,我们将其命名为TaZFP-1.对该cDNA核苷酸序列、氨基酸序列、理化性质、疏水/亲水性、二级结构、结构域、与其它植物的RING finger泛素蛋白连接酶的同源比较和系统进化树进行了预测和分析。结果表明：TaZFP-1基因共759个核苷酸编码252个氨基酸,蛋白质的分子量为27.9 kD,理论等电点PI为6.23；TaZFP-1蛋白的大部分氨基酸为亲水性氨基酸,因此推测TaZFP-1是一可溶性蛋白；二级结构预测表明,TaZFP-1蛋白以α螺旋、β折叠和无规则卷曲为主；通过结构域分析发现,TaZFP-1蛋白在196～233位氨基酸之间有一保守的结构域,该结构域中富含半胱氨酸,形成典型的C3HC4锌指结构；同源序列比对发现不同植物的RING finger泛素蛋白连接酶的氨基酸序列差异较大,但在C端都具有C3HC4锌指结构的保守区；进化树分析表明TaZFP-1蛋白与水稻的RING finger泛素蛋白连接酶的相似性最高,为73%。推测TaZFP-1与水稻的RING finger泛素蛋白连接酶具有相似的功能。5.利用RT-PCR与RACE相结合的方法,我们从小麦三雌蕊突变体(TP)幼穗中克隆出一内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)基因的全长cDNA序列,并将其命名为TaEG。对该序列的核苷酸序列、氨基酸序列、.理化性质、疏水/亲水性、二级结构和三级结构、跨膜结构域以及与其他植物EGases的同源性进行了预测和分析。结构表明：TaEG的全长cDNA序列由2174个核苷酸组成,编码622个氨基酸,蛋白质的分子量为69.07kD,理论等电点PI为9.39；TaEG的大部分氨基酸序列为亲水性氨基酸,因此推测TaEG蛋白为一可溶性蛋白；二级结构预测表明,TaEG蛋白以α螺旋、β折叠和无规则卷曲为主；跨膜结构分析发现,在TaGE蛋白的N端74～96位氨基酸处形成一跨膜区域,因此推测TaGE是一跨膜蛋白型EGase。聚类分析.结果同样证实TaGE是一跨膜蛋白型EGase。本研究为深入探讨TaGE的性质及其在小麦雌蕊发育中的作用奠定了基础。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-16
第一章 概论  16-31
  1 小麦花发育的形态学研究  16-18
    1.1 小麦穗、花的构造  17
    1.2 小麦穗分化的过程  17-18
  2 花发育的"ABC"模型与MADS-BOX基因  18
  3 小麦花发育研究进展  18-24
    3.1 小麦中的A类基因  19-21
    3.2 小麦中的B类基因  21
    3.3 小麦中的C类基因  21-22
    3.4 小麦中的D类基因  22-23
    3.5 小麦中的E类基因  23-24
  4 基因差异表达的研究方法  24-29
    4.1 抑制性差减杂交技术  24-26
    4.2 引物退火控制技术  26-29
  5. 小麦三雌蕊突变体研究进展  29-30
  6 本研究的目标与方法  30-31
    6.1 研究目标  30
    6.2 研究方法  30-31
第二章 小麦三雌蕊性状近等基因系的培育与SRAP分子标记检测  31-41
  1 前言  31-32
  2 材料与方法  32-36
    2.1 实验材料  32
    2.2 实验方法  32-36
      2.2.1 近等基因系的培育及农艺性状评价  32
      2.2.2 SRAP分析  32-36
  3 结果与分析  36-39
    3.1 近等基因系的培育及农艺性状评价  36-37
    3.2 SRAP引物筛选与分子标记的扩增结果  37
    3.3 遗传相似性  37-38
    3.4 聚类分析  38-39
  4 讨论  39-41
第三章 利用抑制性差减杂交分离小麦三雌蕊突变体幼穗中差异表达基因  41-67
  1 前言  41-42
  2 材料与方法  42-55
    2.1 供试材料  42
    2.2 试剂与仪器  42
      2.2.1 试剂  42
      2.2.2 主要仪器  42
    2.3 试验方法  42-55
      2.3.1 总RNA的提取  42-43
      2.3.2 mRNA分离纯化  43-44
      2.3.3 cDNA第一链合成  44
      2.3.4 cDNA第二链合成  44-45
      2.3.5 cDNA的纯化  45
      2.3.6 cDNA RsaI酶切  45-46
      2.3.7 接头连接  46-47
      2.3.8 差减杂交  47
      2.3.9 两轮差减PCR  47-49
      2.3.10 两次差减PCR产物的纯化  49
      2.3.11 差减文库的克隆  49-51
      2.3.12 斑点杂交  51-53
      2.3.13 测序及序列分析  53
      2.3.14 Realtime-PCR检测  53-55
  3 结果与分析  55-64
    3.1 总RNA的分离  55-56
    3.2 MRNA分离结果  56
    3.3 差减效率验证  56-57
    3.4 差减cDNA文库的筛选  57-58
    3.5 斑点杂交结果  58
    3.6 序列分析  58-64
      3.6.1 CM28TP正向SSH cDNA文库序列分析  58-60
      3.6.2 CSTP正向SSH cDNA文库序列分析  60-63
      3.6.3 两个SSH cDNA文库的比较分析  63-64
      3.6.4 Realtime-PCR检测  64
  4 讨论  64-67
第四章 利用引物退火控制技术分离小麦三雌蕊突变体幼穗中差异表达基因  67-77
  1 前言  67-68
  2 材料与方法  68-72
    2.1 试验材料  68
    2.2 试剂与仪器  68
      2.2.1 试剂  68
      2.2.2 主要仪器  68
    2.3 试验方法  68-72
      2.3.1 RNA提取  68
      2.3.2 cDNA第一链的合成  68-69
      2.3.3 ACP差异显示RT-PCR  69-70
      2.3.4 差异条带的回收  70
      2.3.5 连接反应  70
      2.3.6 宿主菌Ecoli DH-5α感受态细胞的制备  70
      2.3.7 转化  70
      2.3.8 菌落PCR  70-71
      2.3.9 测序及序列分析  71
      2.3.10 Realtime-PCR检测  71-72
  3 结果与分析  72-74
    3.1 总RNA的分离  72-73
    3.2 ACP差异显示RT-PCR结果  73
    3.3 序列分析结果  73-74
    3.4 Realtime-PCR检测结果  74
  4 讨论  74-77
第五章 小麦一个RING FINGER泛素蛋白连接酶CDNA序列的克隆及生物信息学分析  77-87
  1 前言  77-78
  2 材料与方法  78-79
    2.1 植物材料  78
    2.2 方法  78-79
      2.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成  78
      2.2.2 TaZFP-1的克隆及序列测定  78-79
      2.2.3 生物信息学分析  79
  3 结果与分析  79-85
    3.1 总RNA提取结果  79-80
    3.2 TAZFP-1的克隆  80
    3.3 TAZFP-1的生物信息学分析  80-85
      3.3.1 TaZFP-1的cDNA序列及氨基酸序列分析  80
      3.3.2 TaZFP-1蛋白的疏水/亲水性分析  80-82
      3.3.3 TaZFP-1蛋白的二级结构预测  82
      3.3.4 TaZFP-1蛋白的结构域分析  82
      3.3.5 TaZFP-1蛋白与其它植物RING finger蛋白序列的比较和进化树分析  82-85
  4 讨论  85-87
第六章 小麦一个内切-1,4-β-葡聚糖酶cDNA序列的克隆及生物信息学分析  87-99
  1 前言  87-88
  2 材料与方法  88-91
    2.1 实验材料  88
    2.2 方法  88-91
      2.2.1 总RNA的提取  88
      2.2.2 RT-PCR法克隆TaEG基因的中间片断  88-89
      2.2.3 利用5'RACE获得TaEG基因的5'端  89-91
      2.2.4 序列拼接及生物信息学分析  91
  3 结果与分析  91-97
    3.1 总RNA提取结果  91
    3.2 RT-PCR法获得TAEG基因的中间片断  91-92
    3.3 RACE法获得TAEG基因cDNA的5'端  92
    3.4 TAEG基因的生物信息学分析  92-97
      3.4.1 TaEG基因的cDNA序列及氨基酸序列分析  92-95
      3.4.2 TaEG蛋白的疏水/亲水性分析  95
      3.4.3 TaEG蛋白的二级结构和三级结构预测  95-96
      3.4.4 TaGE蛋白的跨膜结构分析  96-97
      3.4.5 不同物种间EGase蛋白的同源性分析  97
  4 讨论  97-99
结论  99-101
参考文献  101-113
致谢  113-114
在读期间发表的论文目录  114-115

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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