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三氧化二砷诱导白血病细胞株自噬性死亡及其分子机制研究

作　者: 刘俊青
导　师: 钱文斌
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 三氧化二砷细胞凋亡白血病,急性骨髓增生异常综合症自体吞噬 Beclin-1 Bcl-2
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

国内外临床研究已经证实三氧化二砷（Arsenic trioxide，As₂O₃）可有效地治疗复发和／或初发的急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia，APL），并能达到完全缓解。由于As₂O₃和化疗药物作用的靶点不同，临床应用时亦没有明显的骨髓抑制；且没有化疗药物的其他严重毒副反应。因此，国内外研究人员试图将As₂O₃应用于其他恶性肿瘤的治疗。在血液肿瘤方面，许多体外实验研究表明：As₂O₃可诱导髓系、淋巴系和浆细胞等恶性血液病细胞株凋亡。在临床研究方面，As₂O₃已经进入治疗慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征（MDS）等疾病的临床Ⅰ期和Ⅱ期研究。但是As₂O₃治疗淋巴细胞白血病的研究报道尚少，其对淋巴细胞恶性肿瘤和MDS的作用机制尚不清楚。本研究采用MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltelra-zoliumbromide）比色法观察As₂O₃对T细胞白血病细胞株Molt-4和MDS细胞株Mutz-1细胞的生长抑制作用。结果发现，As₂O₃可显著抑制两种白血病细胞株的生长，并呈时间—剂量依赖性。药物作用48小时对Molt-4细胞的半数抑制浓度（IC50）为4.68μmol／L，对Mutz-1细胞的IC50为1.79μmol／L。用碘化丙啶（PI）和AnnexinV对As₂O₃处理的白血病细胞株双标记，流式细胞仪（FACS）检测结果显示Annexin V⁺、PI^-细胞（即凋亡细胞）呈剂量依赖性增加，提示As₂O₃导致了白血病细胞凋亡。同时，FACS分析结合TUNEL检测法表明：As₂O₃诱导的死亡细胞一部分是TUNEL阴性的。荧光显微镜下观察细胞在细胞膜没有破坏的情况下PI能否染色细胞，结果显示：药物处理48h后，细胞被PI所标记，提示药物处理能够导致白血病细胞发生非凋亡形式的死亡。Western-Blot分析结果显示：药物作用Molt-4细胞后，启动Caspase蛋白，即Caspase-8和Caspase-9被激活，呈时间依赖性；Bid也被激活，提示Caspase-9可能通过Bid的激活而被激活。执行Caspase蛋白中，Caspase-7呈时间依赖性激活，而Caspase-3、Caspase-6没有显著变化。Caspase抑制剂实验结果显示：Pan-caspase抑制剂能部分抑制As₂O₃诱导的Molt-4细胞凋亡，而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制剂均不能抑制As₂O₃诱导的Molt-4细胞死亡。应用透射电镜观察药物作用前后白血病细胞的超微结构。实验结果显示，药物作用后，白血病细胞的细胞膜不完整，胞浆中出现大量囊泡。提示As₂O₃诱导的Molt-4和Mutz-1细胞发生了自噬性细胞死亡，有别于细胞凋亡。磷脂酰肌醇激酶3（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K／AKT）通路的抑制剂（3-MA）预育后再和As₂O₃共同作用于白血病细胞株（4μM As₂O₃作用于Molt-4细胞48h，2μM As₂O₃作用于Mutz-1细胞48h），流式细胞仪（PI和FSC参数）分析3-MA对As₂O₃诱导的非凋亡细胞的抑制作用，结果表明3-MA显著抑制了非凋亡细胞的产生，同时3-MA显著增加了细胞凋亡。用Western-blot分析结果显示用三氧化二砷作用后的Molt-4细胞磷酸化的AKT上调，而用3-MA作用后的磷酸化的AKT下调，进一步证明As₂O₃诱导了白血病细胞发生自噬性死亡。近年来研究发现，自噬性细胞死亡作为非细胞凋亡死亡的一种主要方式在恶性肿瘤的发生和发展中起着十分重要的作用。但目前对血液肿瘤的自噬性细胞死亡及其机制尚不清楚。Jia等报道肿瘤坏死因子α诱导T淋巴细胞白血病细胞株发生凋亡前有自体吞噬现象发生。动物实验研究表明，Beclin-1—人类Bcl-2相互作用蛋白基因敲除的小鼠容易发生上皮细胞和血液系统恶性肿瘤。Saeki等报道应用Beclin-1反义寡核苷酸处理HL-60细胞导致了自噬性细胞死亡。2003年Kanzawa等的研究表明As₂O₃可诱导神经胶质瘤肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡，但作用机制还不清楚。这些研究和我们的实验结果均提示自体吞噬和自噬性细胞死亡在血液肿瘤的发生、发展中起重要作用，对血液肿瘤细胞的自噬性死亡及其信号途径研究将有可能为血液肿瘤的治疗提供新的靶点。我们应用Western-blot和定量实时RT-PCR研究了As₂O₃对白血病细胞株Beclin-1表达的影响。结果表明：在蛋白水平，As₂O₃显著上调了白血病细胞株Beclin-1的表达，呈时间和剂量依赖性。而在mRNA水平，As₂O₃对Beclin-1的表达无影响。用蛋白合成抑制剂（CHX）能显著抑制As₂O₃对白血病细胞株Beclin-1表达的上调作用，提示As₂O₃对白血病细胞株Beclin-1表达的影响是发生在转录后水平的；As₂O₃可能通过使Beclin-1表达增加导致细胞发生自体吞噬，进一步引起自噬性细胞死亡。由于Bcl-2家族与自体吞噬的发生有密切关系，我们进一步研究了As₂O₃对白血病细胞株Bcl-2家族蛋白表达的影响。结果表明：药物作用后，Molt-4细胞Bcl-2蛋白表达明显下调，呈时间依赖性。Bax蛋白表达呈时间—剂量依赖性下调。而Bak蛋白没有明显受到影响。为了了解As₂O₃影响Molt-4细胞Bax和Bak表达的机制，我们用定量实时RT-PCR检测了药物作用后Bcl-2家族相关基因mRNA水平的变化；结果显示：在mRNA水平，Bax表达和Bak表达没有受到影响。提示As₂O₃对Bax的调控发生在转录后水平。综上所述，我们的研究结果表明：（1）在临床有效血药浓度范围内，As₂O₃显著抑制Molt-4细胞（2μmol／L-6μmol／L）和Mutz-1细胞（1μmol／L—3μmol／L）的增殖；As₂O₃对这两种白血病细胞株的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。药物作用48小时，Molt-4细胞的IC50大于4μmol／L；而药物作用48小时后Mutz-1细胞的IC50为1.79μmol／L。表明Mutz-1细胞株对三氧化二砷的敏感性高于Molt-4细胞株。（2）As₂O₃对两种白血病细胞株有诱导凋亡作用，但也有非凋亡死亡。药物作用后有Caspase-8和Caspase-9的激活，Bid也被激活，提示Caspase-9可能通过Bid的激活而被激活。执行Caspase蛋白中，Caspase-7呈时间依赖性激活，而Caspase-3、Caspase-6没有显著变化。Pan-caspase抑制剂能部分抑制三氧化二砷诱导的Molt-4细胞凋亡，而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制剂均不能抑制三氧化二砷诱导的Molt-4细胞死亡。（3）Rhodamin123染色表明，药物作用后细胞的线粒体膜电位没有显著变化；细胞超微结构和磷脂酰肌醇激酶3抑制剂（3-MA）研究结果显示As₂O₃可诱导Molt-4和Mutz-1细胞发生自噬性细胞死亡。Western blot分析提示As₂O₃可能通过使Beclin-1蛋白表达增加导致细胞发生自体吞噬，进一步引起自噬性细胞死亡。（4）As₂O₃对白血病细胞株Bcl-2家族蛋白表达也有影响。三氧化二砷作用后，Molt-4细胞Bcl-2蛋白表达明显下调，呈时间依赖性。Bax蛋白表达也呈时间—剂量依赖性下调。而Bak蛋白没有受到影响。用定量实时RT-PCR证明：这种调节发生在转录后水平。As₂O₃对Bcl-2家族蛋白表达的影响可能与其诱导自噬性死亡有关。

全文目录

一、中文摘要  3-7
二、英文摘要  7-12
三、正文  12-47
  前言  12-15
  材料和方法  15-25
  结果  25-38
  讨论  38-42
  小结  42-43
  参考文献  43-47
四、综述  47-57
  参考文献  53-57
五、发表文章和参与课题  57-58
六、致谢  58

三氧化二砷诱导白血病细胞株自噬性死亡及其分子机制研究

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