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海洋细菌HZ105和ZC1产琼胶酶的研究

作　者: 林伯坤
导　师: 胡忠
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 菌株鉴定 琼胶酶 分离纯化 基因克隆 重组表达 串联质谱
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高值化的关键技术之一。琼胶酶(agarase)是可以将琼胶(琼脂)降解为琼胶寡糖的酶。不同聚合度的琼胶寡糖已被发现具有越来越多的生理功能活性,生产系列琼胶寡糖也成为了琼胶酶的一个主要应用。此外,琼胶酶还可以用于琼脂糖电泳中的核酸回收、制备海藻细胞原生质体、筛选信号肽序列等。目前的琼胶酶主要来自海洋细菌。本论文首先采集汕头海域表层沉积物和富含琼胶的紫菜藻体样品,从中筛选得到两株高产琼胶酶的海洋细菌HZ105和ZC1。通过对菌株的常规特性分析和分类鉴定,菌株HZ105归属于Agarivorans,命名为Agarivorans sp.HZ105。而16SrDNA序列分析结果,同时结合细胞形态、全细胞脂肪酸组分、碳源利用、部分生理生化性质、基因组GC含量等分析表明,菌株ZC1应作为标准菌株建立一个新属,其中菌株ZC1是一株代表新种的菌株。进一步研究了培养时间、培养基pH和NaCl浓度对两菌株生长和产琼胶酶的影响。其中菌株HZ105在pH7-10、NaCl浓度为1-3%范围内培养16h产琼胶酶最好,说明菌株HZ105偏好碱性环境生长,其所产琼胶酶也可能耐碱性。此外,菌株HZ105的胞外琼胶酶粗酶液在室温存放2天后还能保持90.9%的酶活力。而菌株ZC1在pH7-8、NaCl浓度为2-3%范围内产琼胶酶最好;但ZC1的营养需求比较特别,只能利用Biolog系统的GN2板95种碳源中葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精等少数碳源。不过菌株ZC1的琼胶酶不是只由琼脂诱导产生,这也是其独特之处,使运用廉价的碳源生产琼胶酶成为可能。采用从聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶回收蛋白的方法分离纯化了菌株HZ105的三个胞外琼胶酶,并通过SDS-PAGE电泳测得了其分子量54kDa、58kDa、105kDa,接着运用串联质谱技术鉴定了该三个琼胶酶,发现这三个酶均为β琼胶酶,属于糖基水解酶50家族。根据琼胶酶的串联质谱结果和Genbank中已报道的相关琼胶酶基因信息,设计引物,通过PCR技术从菌株HZ105中克隆了一段分子量约为105kDa的琼胶酶的编码基因,成熟蛋白编码序列长2931bp,将该基因序列比对NCBI的CDD保守区数据库,未搜索到保守区,说明其可能存在新的活性催化部位。将该基因与pET-32a(+)构建重组表达载体,转化大肠杆菌,初步探索了琼胶酶基因的重组表达。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
缩略语  6-7
目录  7-9
前言  9-17
  1 琼胶和琼胶酶  9
  2 琼胶酶的研究进展  9-14
    2.1 琼胶酶的来源  9-11
    2.2 天然琼胶酶的研究进展  11-12
    2.3 琼胶酶的编码基因及其重组表达的研究进展  12-13
    2.4 国内有关琼胶酶的研究状况  13-14
  3 琼胶酶的应用  14-15
    3.1 生产琼胶寡糖  14-15
    3.2 琼胶酶在分子生物学研究中的重要应用  15
  4 本文的主要研究内容和意义  15-17
第一章 产琼胶酶菌株的筛选和鉴定及其特性研究  17-39
  1 材料和方法  17-23
    1.1 试剂和培养基  17
    1.2 产琼胶酶细菌的筛选  17-18
    1.3 菌株的鉴定  18-21
    1.4 DNS法测定琼胶酶活性  21-22
    1.5 不同条件对菌株生长和产胞外琼胶酶的影响  22-23
    1.6 菌株产胞外琼胶酶的特性  23
    1.7 蛋白质浓度测定  23
  2 结果  23-37
    2.1 产琼胶酶菌株的筛选  23-25
    2.2 产琼胶酶菌株的鉴定  25-30
    2.3 不同培养条件对菌株生长和产琼胶酶的影响  30-34
    2.4 菌株产胞外琼胶酶的特性  34-35
    2.5 菌株ZC1与相近种属的性质比较  35-37
  3 讨论  37-39
第二章 菌株HZ105琼胶酶的分离纯化和质谱鉴定  39-45
  1 材料和方法  39-41
    1.1 试剂  39
    1.2 琼胶酶的分离纯化  39-40
    1.3 琼胶酶的质谱鉴定  40-41
  2 结果与分析  41-43
    2.1 琼胶酶的分离纯化  41
    2.2 琼胶酶的质谱鉴定  41-43
  3 讨论  43-45
第三章 菌株HZ105琼胶酶编码基因的克隆和表达  45-55
  1 材料和方法  45-48
    1.1 试剂和材料  45-46
    1.2 琼胶酶基因的克隆  46-47
    1.3 琼胶酶基因的表达  47-48
  2 结果  48-53
    2.1 琼胶酶基因的克隆  48-49
    2.2 琼胶酶基因的表达  49-53
  3 讨论  53-55
结论与展望  55-56
  1 结论  55
  2 展望与研究设想  55-56
参考文献  56-64
附录  64-67
致谢  67-68
发表论文情况  68-69
本人简历  69

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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