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RMP对肝癌细胞增殖的影响及其分子机制研究

作　者: 郭云兰
导　师: 魏文祥
学　校: 苏州大学
专　业: 药理学
关键词: RMP 肝癌细胞肝细胞细胞周期细胞凋亡
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:本课题主要研究RMP对肝癌细胞增殖和凋亡的影响极其分子机制。体外实验着重研究RMP基因沉默和过表达对肝癌细胞生长增殖能力、迁移能力、粘附能力、细胞周期以及凋亡的影响及其机制。体内则通过裸鼠皮下荷瘤实验,构建裸鼠肝癌移植瘤模型,探讨RMP基因治疗/基因干预对肝癌移植瘤生长作用的机制。方法:首先,通过脂质体转染技术将RMP干扰质粒和RMP过表达质粒转染到肝癌/肝细胞中,建立RMP干扰和过表达瞬时表达细胞株,采用RT-PCR方法检测RMP在细胞中的表达水平;MTT法检测不同转染组细胞的生长增殖能力和粘附能力;通过划痕实验检测细胞的迁移能力;PI染色后经流式细胞术检测不同转染组细胞周期的变化;Annexin V-FITC-PI染色后经流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡; Western-blot方法检测HL-7702细胞中各转染组细胞凋亡相关基因的表达;我们还通过裸鼠皮下荷瘤实验,建立裸鼠肝癌移植瘤模型,在裸鼠人肝癌细胞SMMC-7721移植瘤的瘤体内注射脂质体-质粒复合物,观察RMP对移植瘤的生长作用的影响;HE染色观察移植瘤细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中RMP、AFP、Bcl-2、Bax和P53蛋白的表达。结果:体外实验:RMP干扰质粒和RMP过表达质粒可以在细胞中瞬时表达;RT-PCR结果显示RMP在不同细胞系中均有不同程度的表达,在肿瘤细胞系中的表达水平普遍高于正常细胞系;MTT结果显示RMP可以促进肝癌细胞和正常肝细胞的增值,降低细胞粘附力;划痕实验提示RMP可以促进细胞的的迁移能力;流式细胞术检测细胞周期显示,RMP被干扰后,肝癌细胞出现明显的G2/M期阻滞,而正常肝细胞的周期则没有明显改变;Annexin V-FITC-PI细胞凋亡检测,RMP干扰后,肝癌细胞凋亡率增加,而肝细胞凋率无明显变化。RMP过表达后,肝癌细胞和肝细胞凋亡均有所降低; RMP基因在HL-7702细胞中过表达后,Western-blot方法检测显示促凋亡基因Bax和Caspase3表达下调,凋亡抑制基因Bcl-2表达上调。体内实验:成功构建了裸鼠肝癌细胞SMMC-7721移植瘤模型。RMP干扰组移植瘤生长缓慢,并且HE染色结果显示细胞凋亡增多,免疫组化检测结果提示干扰RMP后,Bax、P53蛋白表达上调,AFP、Bcl-2蛋白的表达下调。结论:本实验研究表明RMP在人的不同细胞系中广泛表达,并且在肿瘤细胞系呈现高表达,正常细胞中低表达;干扰RMP基因在体内外均能能有效地抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,RMP在肝癌的基因治疗/基因干预提方面可能是一个潜在的有价值的作用靶点;在正常肝细胞HL-7702研究中发现,RMP能够促进肝细胞的增殖、增强细胞迁移力和降低细胞粘附力,提示RMP可以使肝细胞恶化甚至有癌变的可能;RMP抑制细胞凋亡的机制可能是通过上调抗凋亡基因Bcl-2的表达,下调凋亡基因Bax和P53的表达实现的。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
引言  9-11
第一部分 RMP 对肝/肝癌细胞生物学特性的影响及其机制研究  11-36
  1 材料与方法  11-21
  2 结果  21-29
  3 讨论  29-32
  参考文献  32-36
第二部分 RMP 对裸鼠肝癌移植瘤生长作用及机制研究  36-47
  1. 材料与方法  36-40
  2. 结果  40-44
  3 讨论  44-45
  参考文献  45-47
结论  47-48
展望  48-49
综述: HBx 与肝细胞肝癌的发病机制  49-58
  参考文献  54-58
攻读硕士学位期间发表和待发表的论文  58-59
本论文受下列课题资助  59-60
缩略词表  60-61
致谢  61-62

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