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冬青科苦丁茶不同种质材料中熊果酸及其同类物的研究

作　者: 李宏杨
导　师: 刘国民
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 苦丁茶 冬青科 熊果酸 五环三萜 分离纯化
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


苦丁茶在我国资源丰富,饮用历史悠久,具有显著的药用功效和保健作用。近年来,对苦丁茶的研究多集中在加工成品茶和茶饮料方面,而对其生理生化机理、精加工和深加工尤其是对苦丁茶功能成分的研究还有待深入探讨。已有研究表明,冬青科苦丁茶含熊果酸、齐墩果酸、白桦酯酸、羽扇豆醇、坡模醇酸、苦丁内酯、冬青甙元、苦丁茶甙元等一系列五环三萜同类化合物。其中最主要的有效药用成份熊果酸,对高血压、高血脂、咽喉肿痛等多种疾病有显著疗效,在抗肿瘤、抗糖尿病、抗HIV、抗炎、护肝以及机体免疫调节等方面已经显现出良好的药理特性。本文就冬青科苦丁茶中以熊果酸为主的五环三萜类化合物的质量分析和分离纯化技术开展研究,旨在筛选出适合熊果酸产业化提取的优良种质资源材料,并寻找一条适于工业化规模生产的工艺流程,促进五环三萜类化合物的生产和利用,以提高苦丁茶产品的附加值,为冬青科苦丁茶产业的发展注入活力。结果表明,冬青科苦丁茶中熊果酸和羽扇豆醇含量高,是提取熊果酸和羽扇豆醇重要的药源植物；分离纯化工艺流程短、成本低、环境友好,产品纯度和回收率都达到了较高的水平。1.建立了高效液相色谱法分析苦丁茶冬青中熊果酸和齐墩果酸含量的方法,色谱条件为：C18反相柱、流动相甲醇-0.2%磷酸水溶液(88：12)、检测波长220nnm、流速0.8ml/min,该方法准确可靠,也适于分析冬青科其它不同种苦丁茶中熊果酸的含量。另外,首次建立了苦丁茶冬青中白桦酯酸的分析方法,色谱条件为：C18反相柱、流动相甲醇-0.2%(V/V)磷酸水溶液(84：16)、检测波长210nm、流速0.8ml/min,白桦酯酸的平均含量为0.28%,分析方法准确可靠。还建立了苦丁茶中羽扇豆醇的分析方法,色谱条件为：C18反相柱、流动相甲醇-水(97：3)、检测波长210nm、流速1.0ml/min,枸骨中羽扇豆醇的平均含量为0.66%,分析方法准确可靠。2.首次比较了冬青科不同种苦丁茶中熊果酸的含量。六种苦丁茶中熊果酸的平均含量有明显差异,熊果酸的平均含量：枸骨(1.64%)>霍山冬青(1.63%)>大叶冬青(1.54%)>五棱冬青(1.23%)>苦丁茶冬青(0.96%)>华中枸骨(0.69%)>苦丁茶产品(<0.28%)。3.首次检测了不同季节和不同部位的苦丁茶冬青中熊果酸的含量。采于4月和7月份的苦丁茶冬青功能叶中熊果酸含量相当,明显高于10月和1月份的材料,一月份材料含量最低,选择春夏期间苦丁茶功能叶来提取熊果酸可以保证高熊果酸含量的原料供应。苦丁茶冬青的根和茎中未检测出熊果酸,功能叶中含量最高(0.95%),嫩芽(0.52%)、茎皮(0.35%)和果实(0.33%)中的含量较少,但都可以作为加工生产熊果酸的原料,有利于原料的充分利用。4.本论文同时还检测了不同原产地的苦丁茶冬青中熊果酸的含量,不同地区和同一地区内的苦丁茶冬青中熊果酸的平均含量都有差异。广东地区的苦丁茶冬青中熊果酸含量较高且相差小,广西和海南地区的较低且与广东地区的相差大,最高的是广东大埔地区,达到0.99%；即使是在同一地区,熊果酸的含量也有明显差异,如广西南宁地区的苦丁茶冬青(0.42%-1.33%)和海南岛中南部的苦丁茶冬青(0.7%-1.19%)。5.乙醇回流提取熊果酸,提取方法简便而易于操作，且适合产业化生产,最佳提取工艺：提取溶剂95%乙醇,固液比1：15,提取温度85℃,提取时间5小时,提取次数3次。在此工艺条件下,苦丁‘茶中熊果酸的最大浸出率为93.83%。6.柱层析法分离纯化熊果酸之前,先对粗提液使用酸碱沉淀法、活性炭脱色和石油醚除杂法进行初步纯化。将乙醇提取液减压浓缩至50%乙醇浓度,先加入10%氢氧化钠溶液调节pH=10,过滤,滤液用5%盐酸溶液调节pH=4.0,静置,过滤沉淀,水洗至中性,充分干燥。将沉淀物溶解于95%乙醇中,按照3g/100ml量加入活性炭,在80℃温度下回流蒸煮1小时,过滤,滤液减压浓缩至干。向其中加入20倍量的石油醚,12h后倾出石油醚,连续浸提3次,去除极性较小的脂溶性杂质,剩余固体物挥干石油醚后溶于75%乙醇中作为上柱液。7.柱层析以X-5型大孔吸附树脂做填料来纯化熊果酸,效果良好,易于应用到大生产。一次分步洗脱纯化工艺：水-20%乙醇-40%乙醇-50%乙醇-80%乙醇(pH=10),熊果酸纯度可达64%以上；二次洗脱纯化工艺：将第一次80%乙醇洗脱液调节乙醇浓度到75%,保持pH=l 0,流速为2.5BV/h过柱纯化,熊果酸的纯度可达77.3%。经过结晶的熊果酸纯度达到85%以上,总的回收率大于50%。8.羽扇豆醇的分离纯化工艺：枸骨粗粉以固液比1：15中加入95%乙醇,在85℃温度下提取3次,每次5小时,过滤。滤液减压浓缩至干,将浓缩物悬浮于蒸馏水中,加入等体积的石油醚,连续萃取4次。萃取物用90%乙醇溶解,再经X-5大孔吸附树脂吸附后,以2BV/h的流速分步洗脱羽扇豆醇：70%(6BV)-80%(2BV)-85%,部分收集85%乙醇洗脱液,合并羽扇豆醇的洗脱液。将洗脱液减压浓缩至干,用95%乙醇结晶两次,得90%纯度的羽扇豆醇,总的回收率大于72%。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-13
1 绪论  13-26
  1.1 苦丁茶的种类及分布  13
  1.2 冬青科苦丁茶的主要化学成分  13-15
  1.3 熊果酸及其同类物的药理作用  15-17
    1.3.1 抗肿瘤活性  15
    1.3.2 抗炎、抗菌作用  15-16
    1.3.3 护肝作用  16
    1.3.4 抗HIV作用  16
    1.3.5 其他药理活性  16-17
  1.4 熊果酸及其同类物的检测方法和分离纯化的研究  17-24
    1.4.1 熊果酸及其同类物的主要提取方法  17-19
      1.4.1.1 回流提取法  17
      1.4.1.2 超声波提取法  17-18
      1.4.1.3 超临界萃取法  18
      1.4.1.4 酶法  18-19
    1.4.2 熊果酸及其同类物的主要纯化方法  19-20
    1.4.3 熊果酸及其同类物的检测方法  20-24
      1.4.3.1 分光光度法  22
      1.4.3.2 薄层色谱法  22-24
      1.4.3.3 高效液相色谱法  24
  1.5 研究目的与内容  24-26
2 HPLC法测定苦丁茶中熊果酸、齐墩果酸、白桦酯酸和羽扇豆醇的含量  26-35
  2.1 前言  26
  2.2 HPLC法测定苦丁茶冬青中熊果酸和齐墩果酸的含量  26-30
    2.2.1 仪器与试剂  26-27
      2.2.1.1 仪器  26
      2.2.1.2 样品与试剂  26-27
    2.2.2 方法与结果  27-29
      2.2.2.1 对照品溶液的制备  27
      2.2.2.2 样品溶液的制备  27
      2.2.2.3 检测波长的确定  27
      2.2.2.4 色谱条件  27-28
      2.2.2.5 线性关系考察  28
      2.2.2.6 精密度实验和重现性实验  28-29
      2.2.2.7 加标回收率实验  29
    2.2.3 讨论  29-30
  2.3 HPLC法测定苦丁茶冬青中白桦酯酸的含量  30-32
    2.3.1 仪器与试剂  30
    2.3.2 方法与结果  30-32
      2.3.2.1 对照品溶液和样品溶液的制备  30
      2.3.2.2 检测波长的确定  30
      2.3.2.3 色谱条件  30-31
      2.3.2.4 线性关系考察  31
      2.3.2.5 精密度实验和重现性实验  31
      2.3.2.6 加标回收率实验  31-32
    2.3.3 讨论  32
  2.4 HPLC法测定苦丁茶中羽扇豆醇的含量  32-34
    2.4.1 仪器与试剂  32
    2.4.2 方法与结果  32-34
      2.4.2.1 对照品溶液和样品溶液的制备  32
      2.4.2.2 检测波长的确定  32
      2.4.2.3 色谱条件  32-33
      2.4.2.4 线性关系考察  33
      2.4.2.5 精密度实验和重现性实验  33
      2.4.2.6 加标回收率实验  33-34
    2.4.3 讨论  34
  2.5 本章小结  34-35
3 冬青科苦丁茶中熊果酸含量的比较分析  35-42
  3.1 实验部分  35-36
    3.1.1 实验材料  35
    3.1.2 实验试剂  35
    3.1.3 实验仪器  35
    3.1.4 实验方法  35-36
      3.1.4.1 对照品溶液的制备  35
      3.1.4.2 样品溶液的制备  35
      3.1.4.3 色谱条件  35-36
      3.1.4.4 分析方法考察  36
  3.2 冬青科六种苦丁茶中熊果酸含量的比较分析  36-38
    3.2.1 比较不同种苦丁茶中熊果酸的含量  36-38
    3.2.2 比较不同产地苦丁茶中熊果酸的含量  38
    3.2.3 苦丁茶产品中熊果酸的含量  38
  3.3 苦丁茶冬青不同季节、不同原产地域和不同基因型的种质材料中熊果酸的含量比较  38-40
    3.3.1 不同季节苦丁茶冬青中熊果酸含量的变化规律  38-40
    3.3.2 不同原产地域苦丁茶冬青中熊果酸含量的差异  40
    3.3.3 不同基因型苦丁茶冬青中熊果酸含量的差异  40
  3.4 苦丁茶冬青不同器官或不同部位中熊果酸含量的比较分析  40-41
  3.5 本章小结  41-42
4 苦丁茶冬青中熊果酸的分离纯化研究  42-50
  4.1 前言  42-43
  4.2 苦丁茶冬青中熊果酸的提取工艺  43-44
    4.2.1 材料与方法  43
    4.2.2 提取溶剂的选择  43
    4.2.3 提取方法的选择  43-44
    4.2.4 提取参数的考察  44
  4.3 酸碱沉淀法纯化苦丁茶冬青中的熊果酸  44-45
    4.3.1 实验方法  44
    4.3.2 结果与分析  44-45
  4.4 活性炭脱色  45
  4.5 石油醚除杂  45
  4.6 柱层析法纯化苦丁茶冬青中的熊果酸  45-48
    4.6.1 材料与方法  46
      4.6.1.1 实验材料与仪器  46
      4.6.1.2 大孔吸附树脂的预处理  46
      4.6.1.3 样品溶液的制备  46
    4.6.2 大孔吸附树脂的吸附实验  46-47
    4.6.3 大孔吸附树脂的解吸实验  47
    4.6.4 分步洗脱纯化熊果酸  47-48
    4.6.5 二次洗脱纯化熊果酸  48
  4.7 结晶法制备熊果酸  48-49
  4.8 本章小结  49-50
5 苦丁茶中羽扇豆醇的分离纯化研究  50-56
  5.1 前言  50
  5.2 醇回流提取羽扇豆醇  50
    5.2.1 实验材料与仪器  50
    5.2.2 实验方法  50
  5.3 石油醚萃取羽扇豆醇  50-51
  5.4 柱层析法分离纯化羽扇豆醇  51-54
    5.4.1 材料与方法  51
      5.4.1.1 实验材料与仪器  51
      5.4.1.2 大孔吸附树脂的预处理  51
      5.4.1.3 样品溶液的制备  51
    5.4.2 大孔吸附树脂的吸附实验  51-52
    5.4.3 X-5型大孔吸附树脂的吸附实验  52-53
      5.4.3.1 上柱液溶剂的体积分数对吸附量的影响  52
      5.4.3.2 上柱液的流速对吸附量的影响  52-53
    5.4.4 X-5型大孔吸附树脂的解吸实验  53
    5.4.5 分步洗脱纯化羽扇豆醇  53-54
  5.5 结晶法制备羽扇豆醇  54
  5.6 本章小结  54-56
6 结论  56-59
参考文献  59-66
在读期间科研成果简介  66-67
附录  67-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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