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竹虫（Omphis fuscidentalis）体内纤维素酶系的酶学性质及分离纯化的初步研究

作　者: 刘新博
导　师: 黄建新
学　校: 西北大学
专　业: 生物工程
关键词: 竹虫纤维素酶系酶学性质分离纯化
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

纤维素是自然界最为丰富的可再生能源,地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中,纤维素占了近一半,而实际上纤维素只有一小部分得到了利用。有效地利用这一可再生资源,将其转化为人类急需的能源,对于解决日益严峻的能源危机有着重大的现实意义。利用纤维素酶将纤维素降解为简单糖,进而发酵生产纤维素乙醇,成为可再生的绿色能源,是当前新能源开发的一个重要途径。由于酶解法分解后的产物较易被回收与利用,且污染较低,纤维素的酶解也就成了目前公认的较为理想的转化方法。而在纤维素乙醇的研发和未来的生产应用中,纤维素酶的成本居高是其将来大规模生产和应用的一大难题。因此,获得高活性和高稳定性的纤维素酶,成为低成本的纤维素乙醇生产中的关键因素。为寻找高活性和高稳定性的纤维素酶,科学家们已对自然界不同来源的物种中作了广泛地筛选,并对已获得的纤维素酶的活性和酶学性质进行了深入的研究。而开发纤维素酶的资源,以获得高活性和特殊酶学性质的纤维素酶,为将来纤维素酶的蛋白质结构分析和改造增加更多的数据,也是纤维素乙醇研发中的一个重要的研究方向。由于动物源纤维素酶系具有一定的独特性和高活性,成为优良性质的天然纤维素酶系筛选的资源。故而,本研究选择了昆虫中食用物纤维的竹虫为材料,对其所含纤维素酶进行了分离纯化及酶学性质的研究。竹虫其幼虫主要寄生于巨竹体内,以富含纤维素的植物性物质为食,利用体内的酶使得纤维素成为其营养来源。由于其消化道不同于草食动物,水解纤维索的酶类可能与瘤胃微生物有所不同。通过获取和分析此类动物来源的纤维素酶,以期发现一些新特性的纤维素酶,为以后利用生物技术获得高性能纤维素酶提供重要基因来源。本文以竹虫为材料,经柠檬酸缓冲液匀浆抽提处理后,获得粗粗酶制剂。通过福林蛋白沉淀反应进一步制备纤维素酶系的活性测试用酶液。利用DNS显色法,扣除对应的分光空白和酶空白,在不同酶浓度梯度下测定了竹虫纤维素酶系的活性及其最适作用条件,此外探讨了金属离子对其纤维素酶系的影响。结果显示滤纸纤维素酶活性为FPU=0.5438 U/ml,底物法活性测定结果为外切-p-1,4-葡聚糖苷酶的底物微晶纤维素的降解活性CB=0.4296 U/ml,内切-p-1,4-葡聚糖苷酶的底物羧甲基纤维素钠的降解活性CMC= 0.3657 U/ml,β-葡萄糖苷酶的底物水杨素的降解活性SA=0.5285 U/ml。此外确定了竹虫体内纤维素酶系FPU的最适pH为10.6,温度为50℃,反应时间为60 min:CB的最适pH为7.0,温度为70℃,反应时间为60 min:CMC (?)的最适pH为9.4,温度为30℃,反应时间为40 min:SA的最适pH为8.2,温度为50℃,反应时间为20 min。这对于筛选天然的优良性质的纤维素酶系提供了参考。

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摘要 3-5Abstract 5-10第一章绪论 10-19 1.1 纤维素酶系的组成及来源 10-12 1.1.1 纤维素酶系的组成 10-11 1.1.2 纤维素酶系的来源 11-12 1.1.3 纤维素酶系的分子结构 12 1.2 纤维素酶系的酶学性质及克隆表达 12-14 1.2.1 微生物纤维素酶系的克隆及表达 12 1.2.2 动物纤维素酶系的克隆及表达 12-14 1.3 纤维素酶系的分离纯化 14-17 1.3.1 纤维素酶系的分离纯化 14 1.3.2 纤维素酶分离的研究现状 14-17 1.4 竹虫的生物学特性 17 1.5 本项研究的目的与意义 17-18 1.6 研究内容 18-19第二章竹虫纤维素酶系的酶学性质 19-33 2.1 实验材料 19 2.2 实验试剂和仪器 19 2.2.1 实验试剂 19 2.2.2 实验仪器 19 2.3 竹虫纤维素酶系的活性测定 19-25 2.3.1 竹虫组织粗酶液的制备 19-20 2.3.2 稀释酶液的蛋白定量 20 2.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制 20 2.3.4 滤纸法(FPL)活性测定 20-22 2.3.4.1. 竹虫纤维素粗酶液对三种底物作用的酶活测定 20-21 2.3.4.2. 竹虫纤维索粗酶液对滤纸纤维素作用的酶活测定 21-22 2.3.5 底物法活性测定 22-24 2.3.5.1 外切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CB)的活性测定 22-23 2.3.5.2 内切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CMC)的活性测定 23 2.3.5.3 β-葡萄糖苷酶(SA)的活性测定 23-24 2.3.6 竹虫纤维素酶系的最适作用条件 24-25 2.3.6.1 最适pH的测定 24-25 2.3.6.2 最适反应温度的测定 25 2.3.6.3 最适反应时间的测定 25 2.4 结果 25-33 2.4.1 竹虫纤维素粗酶液的蛋白定量 25 2.4.2 葡萄糖标准曲线的绘制 25-26 2.4.3 滤纸法(FPU)活性测定 26 2.4.4 底物法活性测定 26-28 2.4.4.1 外切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CB)的活性测定 26-27 2.4.4.2 内切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CMC)的活性测定 27 2.4.4.3 β-葡萄糖苷酶(SA)的活性测定 27-28 2.4.5 竹虫纤维素酶系的最适作用条件 28-33 2.4.5.1 pH对竹虫体内纤维素酶系的影响 28-30 2.4.5.2 温度对竹虫体内纤维素酶系的影响 30-31 2.4.5.3 反应时间对竹虫体内纤维素酶系的影响 31-33第三章竹虫体内纤维素酶系的分离纯化 33-41 3.1 主要仪器设备及试验试剂 33-35 3.1.1 主要仪器设备 33-34 3.1.2 主要实验试剂 34-35 3.1.2.1 试验药品 34 3.1.2.2 试剂及母液配置 34-35 3.2 试验方法 35-37 3.2.1 竹虫组织粗酶液的制备及离心 35 3.2.2 离子交换层析 35-36 3.2.3 凝胶过滤层析 36 3.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 36-37 3.3 结果 37-39 3.3.1 离子交换层析 37-38 3.3.2 凝胶过滤层析 38-39 3.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 39 3.4 讨论 39-41第四章小结 41-43参考文献 43-49致谢 49-50作者简介 50

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