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肽脱甲酰基酶的表达纯化及其抑制剂的研究

作　者: 王兰兰
导　师: 姚智
学　校: 天津医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 肽脱甲酰基酶大肠杆菌金黄色葡萄球菌纯化蛋白活性 MIC
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的：肽脱甲酰基酶(PDF, peptide deformylase)是筛选新型抗生素的一个理想靶点,其抑制剂的研究引起了广泛的关注。在本研究中,通过不同的表达纯化方法,获得稳定性好、活性高的大肠杆菌和金黄色葡萄菌的PDF,建立PDF抑制剂的筛选模型。检测其抑制剂对两种PDF的抑制效果,同时检测PDF抑制剂的最小抑菌浓度(MIC, minimal inhibitory concentration),对抑制剂进行筛选。为PDF性质的研究和新型抗生素的筛选奠定良好的基础。方法：1.将大肠杆菌PDF表达质粒pET-22b-def转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,对诱导表达的条件进行摸索,并进行PDF蛋白的大量表达。2.通过离子交换层析和分子筛层析,对大肠杆菌PDF进行纯化。3.检测大肠杆菌PDF的活性及稳定性。4.构建金黄色葡萄球菌PDF重组表达质粒pET-22b-def。5.将金黄色葡萄球菌PDF表达质粒pET-22b-def转入宿主大肠菌BL21(DE3)中,进行诱导表达,采用琼脂糖磁珠对其进行纯化,得到不含离子的PDF；在纯化过程中加入氯化镍,得到镍离子PDF；在表达和纯化过程中加入氯化铁,得到富含铁离子的PDF。6.对金黄色葡萄球菌三种不同形式的PDF进行活性比较,并对抑制剂筛选模型的条件进行摸索,建立合适的筛选模型。7.检测化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌PDF的ICso值。8.应用微量稀释法敏感实验的方法检测了39种化合物对4株革兰阴性菌和4株革兰阳性菌的MIC值。结果：1.在30℃下,经0.2mMIPTG诱导表达4小时,大肠杆菌PDF蛋白在宿主菌中得到大量表达。1L菌液可表达蛋白约30mg。2.经过离子交换层析和分子筛层析纯化后,得到了高纯度的大肠杆菌Ni2+-PDF蛋白。3.活性检测证实我们得到了活性高、稳定性好的大肠杆菌Ni2+-PDF蛋白,可用于PDF抑制剂的筛选。4.重组菌落PCR鉴定和基因测序表明,我们成功构建了金黄色葡萄球菌PDF表达质粒pET-22b-def。5.在不同的表达和纯化条件下,得到了高纯度的未加入离子的PDF、含镍离子PDF、富含铁离子PDF三种不同形式的金黄色葡萄球菌PDF蛋白。6.金黄色葡萄球菌不含离子PDF、镍离子PDF和富含铁离子PDF经活性比较发现,富含铁离子PDF活性最高,并用于体外PDF抑制剂的筛选实验。7.检测了39种化合物对大肠杆菌PDF抑制效果,与阳性对照药物放线酰胺(actinonin)相比较,未发现抑制效果优于actinonin的药物。另外检测了19种化合物对金黄色葡萄球菌PDF的抑制效果,亦未发现抑制效果优于actinonin的药物。8.在微量稀释法敏感实验中,与阳性对照药庆大霉素相比,所筛选化合物抑菌效果差于庆大霉素,与actinonin相比,BLC-44对大肠杆菌和克雷伯肺炎杆菌的抑菌效果优于actinonin,其他药物抑菌效果不及actinonin。结论：经表达纯化,获得了稳定性好及活性高的大肠杆菌Ni2+-PDF和金黄色葡萄球菌的富含铁离子PDF蛋白,并建立了PDF抑制剂的筛选的实验模型。对化合物进行了筛选,与阳性对照药actinonin相比,未发现抑制效果优于actinonin的药物。在MIC的检测中,亦未发现抑菌效果好药物。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-10
前言  10-13
  研究现状、成果  10-12
  研究目的、方法  12-13
一、大肠杆菌肽脱甲酰基酶的表达、纯化、活性检测  13-26
  1.1 对象和方法  13-20
  1.2 结果  20-25
  1.3 小结  25-26
二、金黄色葡萄球菌肽脱甲酰基酶的表达、纯化、活性检测  26-44
  2.1 对象和方法  26-35
  2.2 结果  35-43
  2.3 小结  43-44
三、PDF抑制剂化合物的筛选  44-57
  3.1 对象和方法  44-51
  3.2 结果  51-56
  3.3 小结  56-57
讨论  57-64
结论  64-65
参考文献  65-70
发表论文和参加科研情况说明  70-71
综述肽脱甲酰基酶的研究进展  71-77
  综述参考文献  74-77
致谢  77

肽脱甲酰基酶的表达纯化及其抑制剂的研究

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